Thông báo

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu hoạt chất.

Báo cáo tóm tắt NCKH

Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu hoạt chất.

Thành viên tham gia: Nghiêm Thị Minh, Nguyễn Bích Ngọc, Đặng Quang Hùng, Vũ Thị Phương Thảo,

Nguyễn Thị Hiền. SV Nguyễn Thị Hạnh, Phạm Thị Thu Trang

Tóm tắt: Tanshinon là nhóm hoạt chất diterpenoid thân dầu quan trọng trong rễ đan sâm. Trong nghiên cứu này, cao rễ đan sâm giàu tanshinon được chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96% và tinh chế bằng phương pháp sử dụng dung môi để hòa tan tạp chất. Cao đan sâm tinh chế là dạng bột khô tơi, màu nâu đỏ đặc trưng của đan sâm, hàm ẩm 4,48 ± 0,11%, hàm lượng tanshinon IIA trong cao đạt 7,76 ± 0,14%, hiệu suất chiết cao đan sâm đạt 2,57 ± 0,05% tính theo khối lượng dược liệu.

 Summary

Extraction and purification of active ingredients-rich danshen root extract

Tanshinones are an importantly lipophilic, diterpenoid structural bioactive group of danshen root with many pharmacological activities. In this study, tanshinones rich extract of danshen root was extracted by using 96% ethanol and purified by using hot water to remove impurities. The obtained refined extract was red brownish dry powder with following characteristics: loss on drying of 4.48±0.11%, tanshinone IIA content of 7.76±0.14%. The overall yield of the established extraction and purification process was 2.57±0.05%, calculating to the weight of dry danshen root.

  1. Đặt vấn đề

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một dược liệu quý thuộc chi Salvia L., họ Hoa môi (Lamiaceae). Rễ đan sâm đã được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền làm thuốc hoạt huyết, thông kinh, giảm đau [1]. Tanshinon là tên gọi chung để chỉ nhóm các hoạt chất diterpenoid thân dầu có trong rễ đan sâm (tanshinon IIA, cryptotanshinnon, tanshinon I, dihydrotanshinon…) với nhiều tác dụng sinh học nổi bật như: giãn mạch vành, tăng tuần hoàn máu [5], chống oxy hóa, giảm cholesterol [2]… Hiện nay, đã có hơn 40 tanshinon được phân lập và xác định, trong đó tanshinon IIA là thành phần có hàm lượng và hoạt tính đáng kể nhất và thường được sử dụng làm chất đánh dấu cho nhóm hoạt chất này trong kiểm tra chất lượng dược liệu [3].

Để điều chế các cao dược liệu giàu hoạt chất, nhiều phương pháp tinh chế dịch chiết đã được nghiên cứu và áp dụng như phương pháp kết tủa (do thay đổi dung môi, pH, nhiệt độ…), trao đổi ion hay phương pháp hấp phụ… Tuy nhiên, các nghiên cứu về nhóm tanshinon hiện nay chủ yếu tiến hành theo hướng phân lập các đơn chất có độ tinh khiết cao bằng các kỹ thuật như kỹ thuật sắc ký lọc gel [4]… Một số ít nghiên cứu điều chế cao đan sâm giàu hoạt chất tanshinon nhưng sử dụng phương pháp khá phức tạp, khó triển khai ở quy mô lớn. Do đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu hoạt chất” được thực hiện với mục tiêu:

+ Xây dựng được quy trình điều chế cao rễ đan sâm giàu các hoạt chất nhóm tanshinon quy mô phòng thí nghiệm, đạt hàm lượng tanshinon IIA ≥ 5,0%.

2.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu và thiết bị

Rễ đan sâm tươi thu hái ở Đồng Văn (Hà Giang). Mẫu được rửa sạch, loại bỏ rễ con và sấy ở 50oC trong tủ sấy tĩnh đến hàm ẩm dưới 14%.

2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất

Tanshinon IIA chuẩn: hàm lượng 99,78%, lô MUST-17022502 từ Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết xuất

Chiết xuất cao rễ đan sâm bằng phương pháp ngâm. Các thí nghiệm chiết xuất sơ bộ được tiến hành như sau: Cân 20,0 g dược liệu vào cốc có mỏ dung tích 250 mL, thêm 140 mL dung môi và tiến hành chiết trong điều kiện nhiệt độ phòng, 12 giờ/lần, có kết hợp khuấy trộn (500 vòng/phút). Ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật gồm: kích thước dược liệu, dung môi và số lần chiết đến hiệu suất chiết được khảo sát thông qua đánh giá hiệu suất chiết tanshinon IIA.

Sau đó, 100 g dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm với dung môi ethanol 96%, chiết 3 lần × 12 giờ/lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu ở mỗi lần chiết lần lượt là 7/1, 5/1 và 5/1. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 55°C) đến thể chất đặc (hàm ẩm < 30%).

2.2.2. Phương pháp tinh chế

Dựa trên các tính chất đặc trưng của nhóm hoạt chất tanshinon trong cao đan sâm như không tan trong nước và các dung môi phân cực, tan trong ethanol, methanol và một số dung môi ít phân cực. Cao đan sâm được tinh chế bằng phương pháp sử dụng dung môi để loại bỏ tạp chất. Tiến hành như sau: Thêm một lượng dung môi thích hợp vào cao đặc đan sâm, tiến hành khuấy trộn trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp. Lọc hỗn hợp trên phễu lọc Buchner, loại phần dịch lọc đã hòa tan tạp chất, rửa phần cắn không tan bằng đồng lượng dung môi đã sử dụng trong giai đoạn loại tạp, hút kiệt dung môi. Cắn chiết sau tinh chế được tiến hành đông khô với điều kiện: tiền đông -70°C trong 24 giờ, thăng hoa 24 giờ ở -40°C, 0,1 mbar thu được cao khô đan sâm giàu tanshinon.

Các yếu tố kỹ thuật quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình tinh chế được khảo sát gồm: loại dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi, hàm ẩm cao đặc và thời gian. Các chỉ số dùng để đánh giá quy trình là hiệu suất thu hồi cao, hàm lượng tanshinon IIA trong cao và hiệu suất thu hồi tanshinon IIA.

Hiệu suất thu hồi cao (%) = Khối lượng cao khô sau tinh chế/Khối lượng cao khô trước tinh chế × 100%.

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%) = Khối lượng tanshinon IIA trong cao tinh chế/Khối lượng tanshinon IIA trong cao thô × 100%.

2.2.3. Phương pháp kiểm nghiệm

Thảo khảo Dược điển Trung Quốc 2015, tiến hành định lượng tanshinon IIA trong cao đan sâm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện: cột c18 Inertsustain® (250 × 4,6 mm, 5 μm); tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 μl; detector quang phổ tử ngoại bước sóng 270nm; pha động: Acetonitril và acid phosphoric 0,026% theo chương trình rửa giải gradient như sau:

Thời gian (phút)

Acetonitril (%)

Acid phosphoric 0,026 % (%)

0 à 20

60 à 90

40 à 10

20 à 30

90

10

Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn trong methanol có nồng độ nằm trong khoảng từ 1 đến 40 μg/mL.

Mẫu thử: hòa tan hoặc pha loãng một lượng mẫu thử bằng methanol để được các dung dịch có nồng độ tanshinon IIA nằm trong khoảng tuyến tính, lọc qua màng 0,45 µm.

3. Kết quả nghiên cứu

3.1. Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng EGCG bằng HPLC

Phương pháp định lượng EGCG trong các mẫu thử bằng HPLC được thẩm định một số chỉ tiêu cơ bản gồm độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và độ lặp lại cho thấy đạt yêu cầu.

  1.  

3.2 Nghiên cứu điều kiện chiết xuất cao đan sâm

3.2.1 Kiểm nghiệm dược liệu

Cân chính xác khoảng 0,300 g bột rễ đan sâm (hàm ẩm 9,87%), cho vào bình nón có nút mài dung tích 100 mL, thêm chính xác 50 mL methanol, cân xác định khối lượng bình nón rồi siêu âm trong vòng 1 giờ. Để nguội, cân lại và bổ sung khối lượng mất đi bằng methanol. Lọc dịch chiết qua màng 0,45 µm, xác định hàm lượng của tanshinon IIA và cryptotanshinon có trong dược liệu bằng HPLC.

Bảng 3.4 Kết quả định lượng tanshinon IIA trong rễ đan sâm

Lần

mcân (g)

Diện tích píc (mAu.s)

Hàm lượng (%)

1

0,3003

1408568

0,27

2

0,3015

1466411

0,28

3

0,3026

1209644

0,23

Trung bình

0,26

Hàm lượng trung bình của tanshinon IIA trong dược liệu là 0,26% tính theo dược liệu khô kiệt (đạt yêu cầu theo Dược điển Việt Nam V). Hàm lượng này được sử dụng để tính toán các hiệu suất chiết trong các thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành khảo sát các điều kiện chiết xuất cao đan sâm giàu tanshinon như: kích thước dược liệu, dung môi chiết, nhiệt độ và phương pháp chiết, số lần chiết. Mỗi mẻ tiến hành với 20 g dược liệu, các kết quả thu được như sau:

    1.  

3.2.2 Khảo sát kích thước dược liệu

Khảo sát 3 mẫu dược liệu: bột qua rây 2 mm, bột qua rây 5 mm và thái lát dày 2-5 mm. Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96%, chiết 3 lần × 24 giờ/lần với tỷ lệ dung môi lần lượt gấp 7, 5 và 5 lần khối lượng dược liệu. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi ở nhiệt độ 50°C dưới áp suất giảm đến thể cao đặc. Cân khối lượng cao, xác định độ ẩm cao và hàm lượng tanshinon IIa trong cao.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kích thước dược liệu đến quá trình chiết xuất cao đan sâm

Kích thước nguyên liệu

Hàm ẩm cao (%)

Hiệu suất chiết tanshinon IIa (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Bột qua rây 2 mm

6,2 ± 1,1

97,2 ± 1,2

2,6 ± 0,3

Bột qua rây 5 mm

7,4 ±  1,4  

96,2 ± 1,9

3,5 ± 0,3

Thái lát dày 2-5 mm

8,3 ± 1,6

96,1 ± 1,6

4,0 ± 0,2

Tăng kích thước dược liệu làm tăng hàm lượng tanshinon IIa trong cao, đồng thời hiệu suất chiết hoạt chất giữa các mẫu nghiên cứu đều khác nhau không đáng kể. Mẫu dược liệu thái lát dày 2-5 mm đươc lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

    1.  

3.2.3 Khảo sát dung môi chiết

Thay đổi nồng độ ethanol trong dung môi chiết từ 50 đến 96%. Chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 12 giờ; lần thứ nhất với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 7/1, hai lần sau tỷ lệ mỗi lần là 5/1, kết hợp khuấy trộn (khuấy từ, 500 vòng/phút). Kết quả hàm lượng các tanshinon trong cao chiết thu được trong bảng sau:

Bảng 3.6 Ảnh hưởng dung môi chiết đến quá trình chiết xuất cao đan sâm

Nồng độ ethanol (%)

50

70

96

Hàm ẩm cao (%)

8,0 ± 1,1

6,2 ± 1,0

5,4 ± 1,5

Hiệu suất chiết tanshinon IIa (%)

73,8 ± 1,2

84,8 ± 2,2

95,1 ± 2,1

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

1,6 ± 0,2

2,4 ± 0,3

3,9 ± 0,6

Tăng nồng độ ethanol từ 50% lên 96% hàm lượng hoạt chất trong cao chiết lại tăng dần. Đồng thời hiệu suất thu hồi tanshinon IIA cũng tăng dần khi tăng nồng độ ethanol. Hiệu suất chiết cao nhất (đạt 95,1% khi chiết bằng ethanol 96%). Do đó để đáp ứng mục tiêu điều chế cao giàu hoạt chất tanshinon IIa, ethanol 96% được lựa chọn sử dụng cho quá trình chiết.

    1.  

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ và phương pháp chiết xuất

Khảo sát 2 điều kiện chiết xuất khác nhau là chiết hồi lưu và chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng.

+ Mẫu 1: Chiết hồi lưu với dung môi ethanol 96%, 3 lần × 3 giờ với các tỷ lệ dung môi gấp 7 lần, 5 lần và 5 lần khối lượng dược liệu. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi ở 50°C dưới áp suất giảm đến thể cao đặc.

+ Mẫu 2: Chiết theo phương pháp ngâm lạnh với dung môi ethanol 96%, 3 lần × 24 giờ với các tỷ lệ dung môi gấp 7 lần, 5 lần và 5 lần khối lượng dược liệu. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi ở 50°C dưới áp suất giảm đến thể cao đặc.

Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ và phương pháp chiết xuất đến quá trình chiết xuất cao đan sâm

Phương pháp chiết xuất

Hàm ẩm cao (%)

Hiệu suất chiết tanshinon IIa (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Chiết hồi lưu

6,0 ± 1,2

94,6 ± 1,5

3,4 ± 0,3

Ngâm lạnh

6,2 ± 1,4

95,1 ± 1,7

4,0 ± 0,2

Phương pháp chiết hồi cho hàm lượng tanshinon IIa trong cao thấp hơn so với hàm lượng tanshinon IIa trong cao chiết bằng phương pháp ngâm lạnh. Điều này có thể do tăng nhiệt độ làm tăng độ hòa tan các thành phần trong rễ đan sâm trong dung môi, đồng thời có thể gây phân hủy một phần tanshinon IIa. Do đó, lựa chọn phương pháp ngâm lạnh.

    1.  

3.2.5 Khảo sát số lần chiết

Tiến hành chiết cao cồn đan sâm theo phương pháp ngâm lạnh, 3 lần × 24 giờ, với tỷ lệ dung môi gấp 7 lần, 5 lần và 5 lần khối lượng dược liệu. Dịch chiết mỗi lần được để riêng, cô ở 50°C dưới áp suất giảm đến thể cao đặc.

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của số lần chiết đến quá trình chiết xuất cao đan sâm

Lần chiết

Hàm ẩm cao (%)

Hiệu suất chiết tanshinon IIa (%)

1

6,5 ± 1,2

70,1 ± 1,6

2

6,8 ± 1,5

21,4 ± 1,4

3

7,2 ± 1,4

5,1 ± 1,1

Sau 3 lần chiết, hiệu suất chiết tanshinon IIA đạt 96,6%. Do đó, lựa chọn số lần chiết cao cồn Đan sâm là 3 lần với tỷ lệ dung môi lần lượt gấp 7 lần, 5 lần và 5 lần khối lượng dược liệu.

Như vậy các điều kiện chiết xuất cao đan sâm giàu tanshinon IIA được lựa chọn: dược liệu thái lát dày 2-5 mm, chiết theo phương pháp ngâm lạnh, dung môi ethanol 96%, chiết 3 lần × 24 giờ, với tỷ lệ dung môi gấp 7 lần, 5 lần và 5 lần khối lượng dược liệu. Cao thô thu được có hàm lượng tanshinon IIA là 4,1%.

  1.  

3.3 Nghiên cứu điều kiện tinh chế

Các hoạt chất thân dầu nhóm tanshinon trong rễ đan sâm như tanshinon IIa, cryptotanshinon,… rất ít tan trong nước, kể cả nước nóng. Trong khi đó, rễ đan sâm chứa nhiều thành phần thân nước như đường, acid hữu cơ, protein,… Mặc dù lựa chọn ethanol 96% làm dung môi trong giai đoạn chiết xuất giúp hạn chế phần lớn các tạp chất này, dịch chiết rễ đan sâm vẫn còn lẫn một số các tạp chất khác. Hàm lượng tanshinon IIA trong cao thô chưa đạt yêu cầu (> 5%). Do đó, với mục tiêu điều chế cao rễ đan sâm giàu các hoạt chất thân dầu nhóm tanshinon (đại diện là tanshinon IIa), quy trình tinh chế được thiết kế như sau: Dịch chiết cồn rễ đan sâm được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến thể chất đặc, thêm một lượng dung môi và khuấy trộn trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp để hòa tan tạp chất, lọc hỗn hợp qua phễu lọc Buchner, rửa tủa bằng đồng lượng dung môi, hút kiệt dung môi và đông khô trên máy đông khô Christ® Alpha 1-LD (Đức) với các điều kiện: tiền đông -70°C trong 24 giờ, thăng hoa 24 giờ ở -40°C, 0,1 mbar. Cao đan sâm giàu tanshinon được kiểm nghiệm hàm lượng tanshinon IIA. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế được khảo sát như sau:

    1.  

3.3.1 Ảnh hưởng của dung môi loại tạp

Dung môi loại tạp chất được lựa chọn khảo sát là nước và cồn thấp độ nhằm hòa tan các tạp chất trong cao thô. Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng sau.

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dung môi loại tạp tới quá trình tinh chế cao đan sâm

Dung môi

Hiệu suất thu hồi cao (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%)

Nước

82,6 ± 1,5

4,8 ± 0,2

96,7 ± 1,2

Ethanol 10%

70,2 ± 2,1

4,9 ± 0,5

83,9 ± 1,8

Ethanol 30%

62,5 ± 1,8

4,9 ± 0,5

74,7 ± 1,5

Hiệu suất thu hồi cao giảm từ 82,6,6% xuống 62,5% khi thay đổi dung môi loại tạp từ nước sang ethanol 30%. Đồng thời, hiệu suất thu hồi tanshinon IIA giảm từ 96,7% khi sử dụng nước làm dung môi loại tạp xuống 74,7% khi sử dụng dung môi loại tạp là ethanol 30%. Trong khi đó, cao tinh chế bằng các dung môi khảo sát đều có hàm lượng tanshinon IIA tăng lên đáng kể so với hàm lượng tanshinon IIA trong cao thô (4,1%), lần lượt đạt 4,8, 4,9 và 4,9% đối với dung môi nước, ethanol 10% và ethanol 30%. Điều này chứng tỏ các dung môi tinh chế đều có khả năng hòa tan tạp chất trong cao thô, giúp làm tăng hàm lượng hoạt chất trong cao sau tinh chế. Cân đối giữa các yếu tố hiệu suất thu hồi cao, hiệu suất thu hồi tanshinon IIA và hàm lượng tanshinon IIA trong cao, nước được lựa chọn làm dung môi loại tạp chất trong quá trình tinh chế cao đan sâm vì nước hòa tan được nhiều tạp chất và hòa tan rất ít hoạt chất nhóm tanshinon trong cao đan sâm.

    1.  

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ hỗn hợp được thay đổi từ 25 đến 90oC để đánh giả ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tinh chế. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tinh chế cao đan sâm

Nhiệt độ (oC)

Hiệu suất thu hồi cao (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%)

25±2

82,6 ± 1,5

4,8 ± 0,2

96,7 ± 1,2

50±2

72,3 ± 1,2

5,2 ± 0,3

91,7 ± 1,4

75±2

60,1 ± 0,9

6,1 ± 0,3

89,4 ± 1,1

90±2

45,4 ± 1,1

7,7 ± 0,4

85,3 ± 1,3

Tăng nhiệt độ từ 25 đến 90oC làm giảm hiệu suất thu hồi cao, từ 82,6% ở 25oC xuống 45,4% ở 90oC. Tương tự, hiệu suất thu hồi tanshinon IIA có xử hướng giảm khi tăng nhiệt độ, từ 96,7% ở 25oC xuống 85,3% ở 90oC. Ngược lại, hàm lượng tanshinon IIA trong cao tăng dần theo chiều tăng của nhiệt độ, từ 4,8% ở 25oC lên 7,7% ở 90oC. Với mục tiêu điều chế cao đan sâm giàu tanshinon, nhiệt độ dung môi loại tạp ở mức 90±2oC được lựa chọn.

    1.  

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/khối lượng cao đặc

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/khối lượng cao đặc (kl/tt) được khảo sát ở các mức 2/1, 5/1, 10/1 và 15/1. Kết quả được trình bày ở bảng sau.

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lê dung môi đến quá trình tinh chế cao đan sâm

Tỷ lệ dung môi/cao đặc (kl/tt)

Hiệu suất thu hồi cao (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%)

2/1

85,1 ± 1,2

4,6 ± 0,1

95,5 ± 0,8

5/1

60,6 ± 1,3

6,3 ± 0,4

93,1 ± 1,1

10/1

45,4 ± 1,1

7,7 ± 0,4

85,3 ± 1,3

15/1

37,4 ± 1,5

7,6 ± 0,3

70,3 ± 1,0

Tăng tỷ lệ dung môi/cao đặc từ 2/1 lên 15/1 làm giảm hiệu suất thu hồi cao, từ 85,1% khi sử dụng tỷ lệ dung môi/cao đặc là 2/1 xuống 37,4% khi tỷ lệ này là 15/1. Đồng thời, hiệu suất thu hồi tanshinon IIA giảm từ 95,5% xuống 70,3% khi thay đổi tỷ lệ dung môi/cao đặc (tt/kl) trong các khoảng khảo sát trên. Với chỉ tiêu hàm lượng tanshinon IIA trong cao, tăng tỷ lệ dung môi/cao đặc từ 2/1 lên 10/1 làm tăng hàm lượng tanshinon IIA trong cao từ 4,6% lên 7,7% tương ứng, tuy nhiên tăng tỷ lệ dung môi/cao đặc lên 15/1 không làm tăng chỉ số này. Do đó, tỷ lệ dung môi/khối lượng cao đặc (tt/kl) được lựa chọn là 10/1.

    1.  

3.3.4 Ảnh hưởng của hàm ẩm cao đặc

Hàm ẩm của cao đặc được khảo sát ở các mức khác nhau từ 5-10% đến 20-25%. Kết quả được thể hiện ở bảng sau.

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của hàm ẩm cao đặc đến quá trình tinh chế cao đan sâm

Hàm ẩm (%)

Hiệu suất thu hồi cao (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%)

20-25

36,1 ± 1,3

7,9 ± 0,4

69,5 ± 1,5

15-20

40,1 ± 1,6

7,6 ± 0,3

74,3 ± 1,1

10-15

45,4 ± 1,1

7,7 ± 0,4

85,3 ± 1,3

5-10

46,3 ± 1,4

7,6 ± 0,3

85,8 ± 1,6

Giảm hàm ẩm cao đặc từ mức 20-25% xuống 10-15% làm tăng hiệu suất thu hồi cao và hiệu suất thu hồi tanshinon IIA. Tiếp tục giảm hàm ẩm cao đặc xuống mức 5-10% không làm tăng 2 chỉ tiêu này. Do đó, hàm ẩm cao đặc được lựa chọn mức 10-15% cho các thí nghiệm tiếp theo.

    1.  

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian khuấy

Thời gian khuấy được thay đổi trong khoảng 5 đến 20 phút. Kết quả được thể hiện ở bảng sau.

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến quá trình tinh chế cao đan sâm

Thời gian khuấy (phút)

Hiệu suất thu hồi cao (%)

Hàm lượng tanshinon IIa trong cao (%)

Hiệu suất thu hồi tanshinon IIA (%)

10

60,3 ± 1,6

6,4 ± 0,7

94,1 ± 1,5

20

54,3 ± 1,4

6,7 ± 0,3

88,7 ± 1,0

30

45,4 ± 1,1

7,7 ± 0,4

85,3 ± 1,3

40

43,1 ± 1,5

7,5 ± 0,6

78,8 ± 1,1

Tăng thời gian khuấy từ 10 đến 30 phút làm giảm hiệu suất thu hồi cao từ 60,3% xuống 45,4%, đồng thời hiệu suất thu hồi tanshinon IIA giảm từ 94,1% xuống 85,3%. Ngược lại, hàm lượng tanshinon IIA trong cao tinh chế tăng từ 6,4% lên 7,7% theo chiều tăng của thời gian khuấy từ 10 lên 30 phút. Do đó, thời gian khuấy được lựa chọn là 30 phút để vừa đảm bảo khả năng hòa tan tạp chất, vừa hạn chế khả năng phân hủy tanshinon IIA do nhiệt độ.

Như vậy các điều kiện thích hợp trong giai đoạn tinh chế cao đan sâm giàu tanshinon gồm: dung môi loại tạp là nước, nhiệt độ 90±2°C, tỷ lệ dung môi/cao đặc là 10/1 (tt/kl), hàm ẩm cao đặc là 10-15%, thời gian khuấy 30 phút.

  1.  

3.4 Quy trình chiết xuất và tinh chế cao đan sâm giàu tanshinon

Dựa trên các khảo sát cụ thể ở từng giai đoạn, quy trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu tanshinon quy mô 100 g/mẻ được xây dựng như sau:

  • Danh mục nguyên vật liệu:

​​​

Nguyên vật liệu

Tiêu chuẩn

Số lượng

Rễ đan sâm (hàm ẩm < 12%, thái lát dày 2-5 mm, tanshinon IIA 0,26%)

DĐNV V

100 g

Ethanol 96%

TKHH

1,7 L

  • Sơ đồ quy trình

 

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu tanshinon

  • Mô tả quy trình

- Chuẩn bị nguyên liệu, chiết xuất: Rễ đan sâm (hàm ẩm dưới 12%) được thái lát dày 2-5 mm. Tiến hành chiết 100 g dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi ethanol 96%, chiết 3 lần × 12 giờ/lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu của 3 lần chiết lần lượt là 7/1, 5/1 và 5/1. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 55°C) đến thể cao đặc (hàm ẩm 10-15%).

- Tinh chế: Thêm 26,0 mL nước nóng (nhiệt độ 90±2oC) vào cao đặc, khuấy trộn trong 30 phút, duy trì nhiệt độ trong quá trình khuấy. Lọc hỗn hợp trên phễu lọc Buchner đến kiệt nước. Cắn sau loại tạp được tiến hành đông khô trong điều kiện: tiền đông -70°C trong 24 giờ, thăng hoa 12 giờ ở -50°C, 0,1 mbar thu được cao khô tinh chế.

- Kiểm nghiệm, đóng gói, bảo quản: Cao rễ đan sâm sau tinh chế được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, hàm ẩm, hàm lượng tanshinon IIA. Cuối cùng, cao được bảo quản trong 2 lần túi PE ở điều kiện 5-8°C, tránh ánh sáng.

  • Đánh giá độ lặp lại của quy trình

Tiến hành lặp lại quy trình trên 3 mẻ, thu được kết quả như sau:

 Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình chiết xuất và tinh chế cao đan sâm giàu tanshinon

Chỉ tiêu

Khối lượng cao (g)

Cảm quan

Hàm ẩm (%)

Hàm lượng (%)

Mẻ 1

2,56

Bột khô tơi, màu nâu đỏ

4,45

7,73

Mẻ 2

2,62

Bột khô tơi, màu nâu đỏ

4,61

7,64

Mẻ 3

2,53

Bột khô tơi, màu nâu đỏ

4,39

7,91

Trung bình

2,57 ± 0,05

-

4,48 ± 0,11

7,76 ± 0,14

Kết quả cho thấy, quy trình khá ổn định ở quy mô 100 g dược liệu/mẻ. Cao đan sâm tinh chế là dạng bột khô tơi, màu nâu đỏ đặc trưng của đan sâm, hàm ẩm 4,48 ± 0,11%, hàm lượng tanshinon IIA trong cao đạt 7,76 ± 0,14%, hiệu suất chiết cao đan sâm đạt 2,57 ± 0,05% tính theo khối lượng dược liệu.

Quan sát hình ảnh phần dịch rửa nước và cao đan sâm sau tinh chế có thể nhận thấy: sau khi loại tạp chất bằng nước nóng, phần dịch rửa đã hòa tan tạp chất có màu đỏ thẫm, phần cao đan sâm có màu đỏ tươi, sáng đặc trưng cho nhóm tanshinon trong đan sâm. Như vậy, sử dụng dung môi loại tạp chất là nước nóng giúp hòa tan các tạp chất khá hiệu quả, cao đan sâm có màu sắc sáng hơn nhiều so với trước tinh chế. Ưu điểm của phương pháp này là cách tiến hành rất đơn giản, nhanh, chi phí thấp khi so sánh với các phương pháp tinh chế khác đã công bố như phương pháp hấp phụ.

Hình 3.4 Hình ảnh phần dịch rửa nước chứa tạp chất (trái) và cao đan sâm sau tinh chế (phải)

Từ hình ảnh cảm quan có thể nhận thấy sự khác nhau rất rõ về màu sắc của cao thô và cao tinh chế: Cao thô lẫn nhiều tạp chất nên có màu đỏ nâu sẫm, cao tinh chế có màu nâu đỏ đặc trưng của đan sâm. Từ hình ảnh sắc ký đồ có thể nhận thấy rõ các tạp chất thân nước (được rửa giải sớm) trong cao thô đã được loại bỏ đáng kể bằng nước nóng, điều này giúp tăng hàm lượng tanshinon IIA trong cao tinh chế. Ngoài tanshinon, trên sắc ký đồ HPLC mẫu cao tinh chế còn xuất hiện nhiều píc của các hoạt chất khác trong nhóm tanshinon trong rễ đan sâm, nhưng do sự hạn chế về chất đối chiếu nên nghiên cứu này chưa tiến hành định lượng được các thành phần này.

 

Hình 3.5 Hình ảnh cao thô (bên trái) và cao sau tinh chế (bên phải)

 ​​​​​​​

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC các mẫu cao đan sâm: cao thô (trên) và cao tinh chế (dưới)

4. Kết luận và kiến nghị

Sau quá trình nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, cụ thể:

Đã xây dựng được quy trình điều chế cao rễ đan sâm giàu các hoạt chất nhóm tanshinon (đạt hàm lượng tanshinon IIA ≥ 5,0%) quy mô phòng thí nghiệm.

- Chuẩn bị nguyên liệu, chiết xuất: Rễ đan sâm (hàm ẩm dưới 12%) được thái lát dày 2-5 mm. Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, dung môi ethanol 96%, chiết 3 lần × 12 giờ/lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu của 3 lần chiết lần lượt là 7/1, 5/1 và 5/1.

- Tinh chế: Cô đặc dịch chiết đến thể chất đặc (hàm ẩm 10-15%), thêm 50 mL nước nóng (nhiệt độ 90±2oC), khuấy trộn trong 30 phút ở nhiệt độ đó. Lọc hỗn hợp trên phễu lọc Buchner đến kiệt nước. Cắn sau loại tạp được tiến hành đông khô trong điều kiện: tiền đông -70°C trong 24 giờ, thăng hoa 12 giờ ở -50°C, 0,1 mbar.

Cao đan sâm tinh chế là dạng bột khô tơi, màu nâu đỏ đặc trưng của đan sâm, hàm ẩm 4,48 ± 0,11%, hàm lượng tanshinon IIA trong cao đạt 7,76 ± 0,14%, hiệu suất chiết cao đan sâm đạt 2,57 ± 0,05% tính theo khối lượng dược liệu.

Trên cơ sở các kết quả đã đạt được, đề tài có một số đề xuất sau:

- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của chất lượng dược liệu đến quá trình chiết xuất và tinh chế cao rễ đan sâm giàu tanshinon.

- Nghiên cứu nâng quy mô quy trình chiết xuất cao rễ đan sâm giàu tanshinon.

Tài liệu tham khảo

1.         NXB Y học, Dược điển Việt Nam V, tr.1152 - 1154.

2.         Chun-Yan Su, et al. (2015), "Salvia miltiorrhiza: traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology", Chinese journal of natural medicines, 13(3), pp. 163-182.

3.         Cui Yan, et al. (2011), "Characterization of Salvia Miltiorrhiza ethanol extract as an anti-osteoporotic agent", BMC complementary and alternative medicine, 11(1), pp. 120.

4.         Tian Guilian, et al. (2002), "Separation of tanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge by multidimensional counter-current chromatography", Journal of Chromatography A, 945(1-2), pp. 281-285.

5.         Yan Xijun (2014), Dan Shen (Salvia Miltiorrhiza) in Medicine 1, Springer, pp. 97-117.