NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI RUTIN VÀ QUERCETIN
TRONG VIÊN NANG CỨNG BMD BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
ThS Nguyễn Thị Hoa Hiên, ThS Ma Thị Hồng Nga
Ths Nguyễn Văn Hưng, Ths Phạm Thị Hương Lý, Ds Lương Lê Uyên Trang,
Sv Nguyễn Đăng Hùng, Sv Nguyễn Hữu Khởi
Tóm tắt: Viên nang BMD được bào chế từ cao của 3 dược liệu hòe hoa, đương quy, diếp cá; rutin và quercetin là 2 thành phần hóa học chiếm hàm lượng cao trong viên được nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC để định lượng đồng thời. Dung môi pha mẫu là MeOH với thể tích 50 mL, thời gian siêu âm 30 phút. Cột phân tích RP C18 (25 cm ×5µm × 4,6 mm). Pha động sử dụng MeOH và Acid acetic 1%, rửa giải theo chương trình gradient. Bước sóng định lượng rutin ở 350 nm và quercetin ở 370 nm, tốc độ dòng 1 mL/phút và thể tích tiêm mẫu là 5 µL. Phương pháp được thẩm định các chỉ tiêu độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại (trong ngày, khác ngày) và độ đúng.
Phương pháp HPLC đã xây dựng được ứng dụng để định lượng rutin và quercetin trong một số lô viên nang cứng BMD cho kết quả hàm lượng rutin và quercetin trong các mẫu thử lần lượt là: Lô 1: 10,31 và 0,63mg, Lô 2: 14,92 và 0,70mg, Lô 3: 19,89 và 0,77mg.
Summary
BMD capsule was made from the extracts of 3 types of herbs including Saphora japonica, Angelica sinensis, Houttuynia cordata; rutin and quercetin which are 2 chemical components with high concentration in capsule, were studied to build a HPLC method for the simultaneous quantification. The solvent used to dissolve the sample was methanol with a volume of 50mL, dissolved by ultrasound bath in 30 minutes. RP C18 (25 cm ×5µm × 4,6 mm) column. Using MeOH and Acid acetic 1% as the mobile phase in gradient elution program. Rutin and quercetin detection wavelength were 350 and 370 nm respectively, flow rate:1mL/min and injection volume: 5µL. Method was validated in term of specificity, system suitability, linearity, repeatability (within-day and between-day repeatability) and accuracy.
The built HPLC method was used for the simultaneous quantification of rutin and quercetin in several batches of BMD capsules resulted in rutin and quercetin concentrations in the test samples: Batch 1: 10,31 and 0,63mg, Batch 2: 14,92 and 0,70mg, Batch 3: 19,89 and 0,77mg, respectively.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Viên nang BMD bào chế từ cao của 3 dược liệu hòe hoa, đương quy, diếp cá và được nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị bệnh trĩ. Trong viên có dược liệu hoa hòe (chiếm 40%) và diếp cá (chiếm 30%) với thành phần chủ yếu là flavonoid (rutin, quercetin, troxerutin, hesperidin, diosmin…), trong đó rutin và quercetin chiếm hàm lượng cao. Tuy nhiên tiêu chuẩn viên nang BMD mới định tính các thành phần, chưa chuẩn hóa được các lô thuốc khi đánh giá kiểm nghiệm thuốc và tác dụng của thuốc. Việc tiến hành nghiên cứu phương pháp định lượng thành phần chính là rutin và quercetin của viên BMD là cần thiết.
Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời rutin và quercetin trong viên nang cứng BMD bằng phương pháp HPLC” với các mục tiêu cụ thể như sau:
1/ Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời rutin và quercetin trong viên nang cứng BMD bằng phương pháp HPLC.
2/ Ứng dụng quy trình đã xây dựng được để định lượng rutin và quercetin trong một số lô viên nang cứng BMD.
2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. 1 NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1 Nguyên vật liệu:
- Mẫu thử: Viên nang cứng BMD được bào chế đạt tiêu chuẩn cơ sở tại nhà máy của công ty Amepharco – Long Biên chứa thành phần như sau:
Cao đặc BMD 325 mg (tương đương với dược liệu: Đương quy 1,1g, Hòe hoa 1,1g, Diếp cá 1,4g ). Tá dược vừa đủ 650 mg
- Chất chuẩn: Rutin chuẩn (HL 95,00%), Quercetin chuẩn (HL 90,87%)
- Hóa chất và dụng cụ: ethanol 96% (Việt Nam), methanol (Trung Quốc), acid acetic (Trung Quốc), methanol (Merk- Đức), acetonitril (Merk - Đức), màng lọc 0,45 µm (Merk), cột sắc ký HPLC RP C18, 25 cm ×5 µm × 4,6 mm (Nhật Bản).
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm: Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S d=0,1mg (Thụy Sỹ); cân phân tích Mettler Toledo XPE d=0,01mg (Thụy Sỹ); hệ thống HPLC Agilent 1260 (Mỹ) gồm các bộ phận: bơm cao áp, buồng cột, detector DAD, phần mềm điều khiển; máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc).
2. 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu
Mẫu chuẩn và mẫu thử được chuẩn bị như sau:
+ Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc, cân 21,92 mg rutin chuẩn và 3,28 mg quercetin chuẩn vào bình định mức 10 mL, thêm 6 mL MeOH, siêu âm tan hoàn toàn, bổ sung MeOH đến vạch, lắc đều. Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ phù hợp.
+ Mẫu thử: cân khối lượng bột thuốc trong 20 viên, trộn đều, tính khối lượng trung bình viên. Cân chính xác khoảng một lượng bột thuốc tương ứng 1 viên vào bình định mức 50 mL, thêm dung môi. Chiết siêu âm 30 phút. Bổ sung dung môi chiết đến vạch, lắc đều, lọc qua màng 0,45 µm.
+ Mẫu trắng: dung môi pha mẫu.
CT tính hàm lượng rutin (quercetin): X (mg/viên) = (C × V × MTB × 100) /
Trong đó: C (mg/mL): nồng độ rutin (quercetin) trong dung dịch thử; V: thể tích bình định mức; m (g): khối lượng mẫu thử; MTB (g): khối lượng trung bình của bột thuốc trong 1 viên.
- Xử lý mẫu: Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu: loại dung môi, thể tích dung môi, thời gian siêu âm để đạt hiệu suất chiết cao nhất.
- Điều kiện sắc ký: lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp như chương trình pha động, thể tích tiêm mẫu, bước sóng định lượng.
2.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng được thẩm định các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của AOAC[4]:
- Độ đặc hiệu: Tiêm dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và so sánh pic thu được. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện tín hiệu pic của chất phân tích tại thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.Trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu trùng với sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Khoảng tuyến tính: Tiến hành sắc ký các dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic. Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa diện tích và nồng độ chất phân tích.Yêu cầu: hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1,00.
- Độ thích hợp hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic sắc ký. Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích píc giữa các lần tiêm mẫu ≤ 2%.
- Độ lặp lại: Cân khối lượng bột thuốc trong 20 viên nang cứng BMD, trộn đều, tính khối lượng trung bình viên.
Độ lặp lại trong ngày: Cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng tương ứng 1 viên vào bình định mức và xử lý mẫu. Tiến hành sắc ký, ghi lại thời gian lưu và diện tích pic sắc ký. Lặp lại với 6 mẫu thử độc lập.Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích pic giữa các lần ≤ 2%.
Độ lặp lại khác ngày: Vào một ngày khác, cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng tương ứng 1 viên vào bình định mức và xử lý mẫu. Tiến hành sắc ký, ghi lại thời gian lưu và diện tích pic sắc ký. Lặp lại với 6 mẫu thử độc lập.Yêu cầu: RSD (%) của hàm lượng rutin và quercetin giữa các lần xử lý mẫu thử ≤ 2%.
- Độ đúng: Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn. Thêm chuẩn vào nền các mẫu thử và xử lý mẫu để được các dung dịch thử thêm chuẩn có nồng độ bằng 120, 150 và 180% so với nồng độ định lượng. Tiến hành sắc ký và tính độ thu hồi của các chất phân tích.Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi từ 98-102% nếu hàm lượng ≥10%, 97-103% nếu hàm lượng trong khoảng 1-10% và 95-105% nếu hàm lượng trong khoảng 0,1-1%.
3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng
3.1.1 Lựa chọn điều kiện định lượng [7]
Cột RP C18 (25 cm ×5µm × 4,6 mm). Pha động: MeOH và Acid acetic 1%, rửa giải theo chương trình gradient như sau:
Thời gian (phút)
MeOH (%)
Acid acetic 1% (%)
0-5
32
68
5-20
32-50
68-50
20-35
50-90
50-10
35-40
90-50
10-50
40-43
50-32
50-68
43-45
Bước sóng định lượng: rutin 350 nm, quercetin 370 nm. Tốc độ: 1mL/phút. Thể tích tiêm: 5µL
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của rutin
Hình 3.2: Phổ hấp thụ UV của quercetin
3.1.2 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu
3.1.2.1 Dung môi xử lý mẫu
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung môi xử lý mẫu
Dung môi
Ethanol 96%
MeOH
Diện tích píc (mAu.s)
Rutin
2014,6
3628,4
Quercetin
203,8
329,9
Nhận xét: MeOH cho diện tích píc chất phân tích lớn hơn nên chọn MeOH làm dung môi pha mẫu. MeOH giúp tăng hiệu suất chiết, tiết kiệm dung mội, hạn chế đáng kể sự hòa tan tạp, đỡ tăng áp suất cột và bảo vệ cột sắc ký tốt hơn.
3.1.2.2 Thể tích dung môi
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thể tích dung môi xử lý mẫu
Thể tích dung môi (mL)
20
50
100
Hàm lượng (%g/viên)
0,94
1,25
0,04
0,05
Nhận xét: Tăng thể tích dung môi từ 20 lên 50 mL làm tăng hàm lượng rutin và quercetin (từ 0,94 lên 1,25%g tương đương từ 9,4 mg lên 12,5mg và từ 0,04 lên 0,05%g tương đương từ 0,4 mg lên 0,5mg). Tăng thể tích lên 100 mL không làm tăng hàm lượng chất phân tích. Do đó, để tiết kiệm dung môi, đạt được hiệu suất chiết cao, chọn thể tích dung môi là 50 mL.
3.1.2.3 Thời gian chiết
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết (phút)
10
30
Hàm lượng (%)
1,20
Nhận xét: Tăng thời gian siêu âm từ 10 lên 20 phút làm tăng hàm lượng rutin và quercetin (từ 1,20 lên 1,25%g tương đương từ 12,0mg lên 12,5mg và từ 0,04 lên 0,05%g tương đương từ 0,4mg lên 0,5mg). Tăng thời gian chiết siêu âm lên 50 phút không làm tăng hàm lượng chất phân tích. Do đó, chọn thời gian chiết siêu âm là 30 phút.
3.2.1 Độ đặc hiệu
Mẫu trắng
Chuẩn rutin
Chuẩn quercetin
Chuẩn hỗn hợp
Mẫu thử
Hình 3.3: Kết quả thẩm định độ đặc hiệu
Bảng 3.4: Thông số đặc trưng cho quá trình rửa giải
Thông số đánh giá
Yêu cầu
Thời gian lưu (phút)
-
19,736
27,432
Hệ số phân giải
≥ 1,5
20,855
Hệ số kéo đuôi
0,8-1,2
1,033
1,045
Số đĩa lý thuyết (N)
> 6000
31793
139084
Nhận xét: phương pháp HPLC đạt yêu cầu độ đặc hiệu và điều kiện sắc ký đã lựa chọn là phù hợp để rửa giải rutin và quercetin trong mẫu.
3.2.2 Độ thích hợp hệ thống
Bảng 3.5: Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống
STT
1
619,6
194,8
2
19,752
619,7
27,463
196,3
3
19,580
625,8
27,344
196,7
4
19,661
635,1
27,325
200,3
5
19,687
620,2
27,370
196,4
6
19,600
620,5
27,360
196,8
Trung bình
19,669
623,5
27,382
196,9
RSD (%)
0,36
0,99
0,20
0,93
Nhận xét: giá trị RSD (%) của thời gian lưu, diện tích píc của 6 lần tiêm lặp lại đều < 2% nên phép thử đạt yêu cầu và độ thích hợp hệ thống.
3.2.3 Khoảng tuyến tính
Bảng 3.6: Kết quả thẩm định độ tuyến tính
Nồng độ (µg/mL)
20,82
154,1
2,98
47,8
41,65
316,1
5,96
99
83,30
11,92
208,24
1529,3
29,81
483,5
416,48
3081,4
59,61
982
832,96
6737,9
119,22
2153,7
Hình 3.4: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ rutin
Hình 3.5: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ quercetin
Nhận xét: đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ của rutin và quercetin có hệ số tương quan R2 lần lượt là 0,9980 và 0,9979 nên đạt yêu cầu về tính tuyến tính.
3.2.4 Độ lặp lại
Bảng 3.7: Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng
KL
Mthử (g)
HLTB (%g/viên)
Ngày 1
0,5863
1960,3
161,6
1,358
0.057
0,5745
1974,2
162,0
1,395
0.058
0,5855
1965,7
162,8
1,363
0,5835
1991,8
166,6
1,385
0,5873
1996,5
165,3
1,379
1993,6
163,9
1,387
1,378
0,057
1,051
1,083
Ngày 2
0,5895
1992,4
162,1
1,372
0.056
0,5834
1998,7
165,5
1,390
0,5862
1999,2
164,4
1,384
0,5881
1978,3
168,4
1,366
0,5813
1984,2
164,2
1990,5
167,8
1,380
0,058
0,669
1,337
Nhận xét: Độ lặp lại trong ngày: RSD (%) của 6 lần thí nghiệm độc lập ngày 1 và 6 lần thí nghiệm độc lập ngày 2 đều < 2% cho thấy phép thử đạt yêu cầu về độ lặp lại trong ngày. Độ lặp lại khác ngày: RSD (%)12 lần thí nghiệm độc lập của 2 ngày < 2% cho thấy phép thử đạt yêu cầu về độ lặp lại khác ngày.
3.2.5 Độ đúng
Bảng 3.8: Kết quả thẩm định độ đúng của phép định lượng rutin
% chuẩn thêm vào
KL cân mẫu thử (g)
Lượng có sẵn (mg)
Lượng thêm vào (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
Lượng tìm thấy (mg)
% tìm lại
% tìm lại trung bình
Mức 1
0,5933
13,00
2,50
2418,1
15,50
99,99
100,54
0,49
0,5832
12,78
2386,2
15,30
100,92
0,5846
12,81
2390,3
15,33
100,71
Mức 2
12,79
7,50
3200,1
20,36
100,93
100,21
0,75
12,85
3202,1
20,37
100,27
0,5904
12,94
3206,7
20,40
99,43
Mức 3
0,5836
10,00
3598,2
22,83
100,36
100,12
1,02
0,5923
12,98
3607,1
22,88
99,00
0,5921
3638,5
23,08
100,99
Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ đúng của phép định lượng quercetin
Khối lượng cân mẫu thử (g)
0,54
0,10
203,1
0,64
100,53
0,24
0,53
199,8
0,63
100,43
200,4
100,82
0,30
270,9
0,83
99,22
100,57
273,5
0,84
100,77
275,9
101,71
0,40
308,8
100,68
99,94
0,66
309,8
99,38
310,3
99,78
Nhận xét: % tìm lại trung bình của rutin và quercetin ở các mức thêm chuẩn nằm trong khoảng quy định rutin (97-103%) và quercetin (95-105%) nên phép thử đạt yêu cầu về độ đúng.
3.3 Áp dụng quy trình định lượng rutin và quercetin trong một số mẫu thử bằng phương pháp HPLC
Bảng 3.10: Kết quả định lượng rutin và quercetin trong một số mẫu thử
Lô
Khối lượng cân (g)
Hàm lượng trung bình viên (%g/viên)
Hàm lượng trung bình viên (mg/viên)
Lô 1
(mTB=0,6299 g)
0,6246
1,031
0,063
10,31
0,6237
1,032
10,32
0,6214
1,030
10,30
Lô 2
(mTB=0,6237 g)
0,6299
1,497
0,070
14,97
0,70
0,6145
1,484
14,84
0,6213
1,495
14,95
1,492
14,92
Lô 3
(mTB=0,6555 g)
0,655
1,956
0,077
19,56
0,77
0,6543
2,007
20,07
0,6556
2,005
20,05
1,989
19,89
Nhận xét: Kết quả cho thấy, phương pháp định lượng cho kết quả có độ lặp lại tốt, hàm lượng rutin và quercetin trong các mẫu thử viên nang cứng lần lượt là: Lô 1: 10,31 và 0,63mg, Lô 2: 14,92 và 0,70mg, Lô 3: 19,89 và 0,77mg.
4. BÀN LUẬN
Phương pháp định lượng đồng thời rutin và quercetin trong viên nang cứng BMD bằng HPLC đã được xây dựng và thẩm định. Sử dụng dung môi MeOH để xử lý mẫu do rutin và quercetin tan tốt trong MeOH hơn so với ethanol. Ngoài ra, viên nang BMD chứa cao đặc hỗn hợp dược liệu là cao chiết nước theo phương pháp chiết nóng nên cao chứa nhiều tạp tan trong nước, trong khi rutin và quercetin tan tốt trong MeOH. Do đó, MeOH được lựa chọn để hòa tan cả 2 chất. Ngoài ra, sử dụng MeOH giúp tiết kiệm dung môi, hạn chế đáng kể sự hòa tan tạp thân nước vào dung môi, đỡ tăng áp suất cột và bảo vệ cột sắc ký tốt hơn.
Về chương trình phân tích, rutin và quercetin đều là các acid yếu nên sử dụng pha động có pH 3-4 sẽ thuận tiện cho quá trình phân tách khi rửa giải. Hiện nay, khuynh hướng sử dụng pha động không chứa dung dịch đệm ngày càng gia tăng để tránh gây mòn hệ thống sắc ký. Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết lập pha động chứa acid acetic không có đệm để phân tách rutin và quercetin. Khi đó với cột phân tách là pha đảo thì rutin (đỉnh chiếm ưu thế) do phân cực hơn quercetin sẽ có thời gian lưu ngắn hơn nên được rửa giải ra trước. Quercetin ít phân cực hơn nên sẽ rửa giải sau.Phương pháp HPLC xây dựng được thẩm định các chỉ tiêu cơ bản theo hướng dẫn thẩm định phương pháp định lượng của AOAC. Kết quả cho thấy, phương pháp HPLC đạt các chỉ tiêu thẩm định gồm: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại (trong ngày, khác ngày) và độ đúng. Phương pháp HPLC xây dựng đã được áp dụng để định lượng hàm lượng rutin và quercetin trong một số mẫu thử viên nang cứng BMD. Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt. Quy trình xử lý mẫu và phân tích đơn giản, dễ thực hiện, dễ áp dụng với các cơ sở kiểm nghiệm ở Việt Nam.
5. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra, gồm:
1/ Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời rutin và quercetin trong viên nang cứng BMD bằng phương pháp HPLC.
Điều kiện xử lý mẫu: dung môi MeOH, thể tích 50mL, thời gian chiết 30 phút.
Điều kiện sắc ký: Cột RP C18 (25 cm ×5µm × 4,6 mm). Pha động: MeOH và Acid acetic 1%, rửa giải theo chương trình gradient như sau:
Bước sóng: định lượng rutin ở 350 nm và quercetin ở 370 nm. Tốc độ: 1 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 5 µL
Phương pháp được thẩm định các chỉ tiêu độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại (trong ngày, khác ngày), độ đúng.
2/ Đã ứng dụng quy trình xây dựng được để định lượng rutin và quercetin trong một số lô viên nang cứng BMD.
Hàm lượng rutin và quercetin trong các mẫu thử viên nang cứng lần lượt là: Lô 1: 10,31 và 0,63mg, Lô 2: 14,92 và 0,70mg, Lô 3: 19,89 và 0,77mg.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Ma Thị Hồng Nga và cs. (2016), "Nghiên cứu tác dụng chống táo bón và bào chế viên nang cứng từ cao lỏng BMD, Đề tài nghiên cứu cấp cơ sở Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội".
2. Nguyễn Thị Minh Diệp, và cs. (2020), "Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời rutin và quercetin trong phần trên mặt đất cây tam giác mạch trên hệ thống HPLC-PDA", Tạp chí Dược liệu, 25(4/2020), tr. 241-246.
3. Phạm Xuân Sinh (2005), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
4. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 5-58.
Tài liệu tiếng Anh
5. Chen and Hsieh (2010), "Effects of Sophora japonica flowers (Huaihua) on cerebral infarction", Chinese Medicine, 5(34).
6. Corsale I., et al. (2018), "Flavonoid mixture (diosmin, troxerutin, rutin, hesperidin, quercetin) in the treatment of I–III degree hemorroidal disease: a double-blind multicenter prospective comparative study", Int J Colorectal, (33), pp. 1595–1600.
7. Dược điển Anh (2020), Sophora Flower Buds.