NGHIÊN CỨU HỆ HAI PHA LỎNG THÂN NƯỚC ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU CHẾ CAO LÁ CHÈ XANH GIÀU CATECHIN

Nghiêm Thị Minh, Ma Thị Hồng Nga, Nguyễn Thị Lan Anh,

 Nguyễn Bích Ngọc, Đặng Quang Hùng.

SV Đỗ Nguyễn Thảo Linh,  SV Nguyễn Như Quỳnh

Tóm tắt: Hệ hai pha thân nước (ATPS) dựa trên alcol/muối được nghiên cứu và ứng dụng trong điều chế cao lá Chè xanh giàu catechin. Trong các hệ khảo sát, hệ EtOH/(NH4)2SO4 có các đặc tính phù hợp nhất và được nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế như tỷ lệ alcol, tỷ lệ muối, pH, nồng độc dịch chiết và thời gian chiết. Kết quả cho thấy, phương pháp tinh chế dựa trên hệ 2 pha thân nước với các điều kiện EtOH 17%, (NH4)2SO4 25%, nồng độ dịch chiết 8% với pH 3-4 và thời gian chiết 10 phút cho sản phẩm cao tinh chế có hàm lượng EGCG là 29,2% và hiệu suất thu hồi cao là 32,2%.

Development of an aqueous two - phase system for preparation of catechin rich green tea leaves extract.

In this research, an aqueous two phase system (ATPS) based on alcohol/salt was developed and applied in preparation of catechin rich green tea leaves extract. Of all alcohol/salt systems screened, EtOH/(NH₄)₂SO₄ showed the best performance. Thus its phase diagram was firstly constructed and then purification parameters, namely, the compositions of ATPS, shaking time, pH and extract concentration were investigated. When applied in preparation of catechin rich extract, method based on ATPS composed of EtOH 17%, (NH₄)₂SO₄ 25%, crude extract concentration 8%  with pH 3-4 and shaking time 10 mins gave 32.2% extract recovery with 29.2% EGCG purity.

1. Đặt vấn đề

Chè (Trà, Camellia Sinensis l.) là một trong những đồ uống phổ biến nhất ở Việt Nam và trên thế giới do hương vị đặc trưng và các tác dụng sinh học quan trọng của các hợp chất polyphenol (chủ yếu là các catechin) trong lá như chống oxy hóa, chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn, chống ung thư [2]. Trong các catechin chè xanh, epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần có hàm lượng lớn nhất và có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất. 

Trong xu hướng công nghệ chiết xuất “xanh”, kỹ thuật chiết phân bố lỏng lỏng sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước (aqueous two phase system, ATPS) đã được nghiên cứu và ứng dụng trong tinh chế một số dịch chiết dược liệu với các ưu điểm: có thể rút ngắn thời gian chiết xuất và tinh chế, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, an toàn với sức khỏe, thân thiện với môi trường, sản phẩm thu được bằng phương pháp này cho độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi cao, dễ nâng quy mô,…. Tuy nhiên ở việt nam, chưa có nghiên cứu nào về kỹ thuật này, đặc biệt ứng dụng trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu. Do đó, đề tài được thực hiện với mục tiêu:

1. Xây dựng được quy trình điều chế cao lá chè xanh giàu catechin sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước alcol/muối.

2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
   1. Nguyên liệu và thiết bị

Cao lá chè xanh chiết bằng dung môi nước và cao lá chè xanh chiết bằng dung môi cồn đạt TCCS. 

2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất

EGCG chuẩn: hàm lượng 99,78%, lô Must-17060113 (Chengdu Must Biological Technology Co., Ltd.).

1. 2. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô

• • • Cao thô chiết bằng nước (cao thô nước): trên cơ sở tham khảo tài liệu [1] và các thí nghiệm khảo sát sơ bộ, cao thô nước lá chè xanh được được điều chế như sau: 200 g lá chè được chiết 2 lần × 1400 ml nước/lần × 2 giờ/lần ở 80-85°C. Gộp các dịch chiết và cô loại dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 70°C) đến khi còn 1/20 thể tích và đông khô. Kết quả thu được 25 g cao thô nước có các tính chất: hàm ẩm 3,4 ± 0,23%, hàm lượng EGCG 10,5 ± 0,3%.
    • Cao thô chiết bằng ethanol 50% (cao thô ethanol 50%): trên cơ sở tham khảo tài liệu và các khảo sát sơ bộ, cao thô ethanol 50% được điều chế như sau: 100 g lá chè được chiết 2 lần × 700 ml ethanol 50%/lần × 12 giờ/lần ở nhiệt độ phòng (~25°C) trong thiết bị chiết có khuấy trộn. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 70°C) đến khi còn 1/10 thể tích và đông khô theo quy trình đông khô. Cao thô ethanol 50% có các tính chất: hàm ẩm 3,7 ± 0,16%, hàm lượng EGCG 15,3 ± 0,5%.

1. 1. 2. Sàng lọc ATPS

Các alcol mạch ngắn như methanol, ethanol, isopropanol và các muối được sàng lọc để lựa chọn ATPS phù hợp. Trong các ống nghiệm trong suốt, hòa tan chính xác một lượng muối trong nước cất, thêm từ từ từng giọt alcol vào dung dịch muối đến khi có sự tách pha, lắc đều và quan sát. 

Tiếp tục thêm một lượng cao thô vào hệ alcol/muối, lắc hòa tan cao, để yên 30 phút và quan sát. Do tính chất tan tốt trong ethanol cao độ nên EGCG và các catechin phân bố chọn lọc lên pha trên (pha giàu alcol).

1. 1. 3. Xây dựng giản đồ pha ATPS Giản đồ pha hệ ethanol/muối được xây dựng bằng phương pháp điểm vẩn đục (Cloud point method). Tiến hành như sau: cân chính xác một lượng muối hòa tan hoàn toàn trong nước cất, dùng micropipet cho từ từ từng giọt ethanol vào đến khi xuất hiện vẩn đục (dấu hiệu bắt đầu có sự tách pha) thì cân lại hệ trên cân phân tích, ghi lại chính xác khối lượng từng thành phần. Sau đó dùng micropipet thêm một lượng nước cho hệ trong trở lại. Lặp lại thao tác thêm ethanol đến điểm vẩn đục rồi lại thêm nước như trên để thu được các điểm vẩn đục với tỷ lệ muối, alcol khác nhau. Mỗi cặp giá trị thành phần của hệ được biểu diễn bằng một điểm trên đồ thị, giản đồ pha được xây dựng thông qua tập hợp các điểm xác định được. Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng (khoảng 25^oC).
      4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế cao thô bằng ATPS

Trong ống ly tâm bằng nhựa 15 ml có nắp, thêm ATPS với các thành phần gồm:

dịch chiết (nước và cao thô), muối và alcol với các tỷ lệ và nồng độ theo khảo sát. Lắc hỗn hợp bằng máy lắc vortex để hòa tan cao thô, muối và trộn lẫn các pha để tạo sự phân bố chọn lọc của các thành phần trong hỗn hợp, sau đó để phân lớp. Để hỗ trợ quá trình tách pha, hệ được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút và thu lấy pha trên, tiếp tục thêm 2 phần thể tích ethanol tuyệt đối để loại muối trong pha trên (nếu có). Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy phần dịch, cô cách thủy còn ¼ thể tích, thêm đồng lượng nước và đông khô. Các yếu tố ảnh hưởng được khảo sát và lựa chọn dựa vào việc xác định hiệu suất thu hồi cao và hàm lượng EGCG trong cao tinh chế.

1. 1. 5. Phương pháp kiểm nghiệm cao lá chè xanh

+ Phương pháp định tính bằng TLC

+ Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 

Tham khảo các tài liệu [3], hàm lượng EGCG trong các mẫu thử được xác định bằng phương pháp HPLC với các điều kiện: cột c18 Inertsustain^® (250 × 4,6 mm, 5 μm); pha động methanol - nước - acid phosphoric (20 : 79,9 : 0,1, tt/tt); tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 μl; detector quang phổ tử ngoại bước sóng 280 nm.

Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn EGCG pha trong nước cất có nồng độ từ 5 đến 200 μg/ml.

Mẫu thử: hòa tan một lượng mẫu thử bằng nước cất để được các dung dịch có nồng độ EGCG nằm trong khoảng tuyến tính, lọc qua màng 0,45 μm. 

Nồng độ EGCG trong các mẫu thử được tính theo đường chuẩn.  

3. Kết quả nghiên cứu
   1. Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng EGCG bằng HPLC

Phương pháp định lượng EGCG trong các mẫu thử bằng HPLC được thẩm định một số chỉ tiêu cơ bản gồm độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và độ lặp lại cho thấy đạt yêu cầu.

1. 2. Sàng lọc ATPS

Trong các alcol khảo sát, methanol có khả năng tách pha kém, ethanol và isopropanol có khả năng tách pha tốt và ổn định với một số muối. Đồng thời ethanol thông dụng và rẻ hơn IPA, nên ethanol được lựa chọn là alcol tạo ATPS. Với alcol là ethanol, các muối NaCl, KH2PO4 không tách pha và dễ tủa muối nên không được lựa chọn. Muối Na2SO4 có sự tách pha nhanh nhưng hệ không ổn định, dễ xuất hiện tủa muối ở pha dưới do độ tan hạn chế của muối.

Các muối còn lại (NaH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, Na₃C₆H₅O₇, K₂HPO₄, K₂CO₃, Na₂CO₃) tạo ATPS bền vững với ethanol. Tiếp tục thêm một lượng cao thô vào các hệ trên, lắc hòa tan hoàn toàn và để phân lớp trong 30 phút. Kết quả quan sát cho thấy, với các muối có pH trung tính và kiềm như Na₃C₆H₅O₇, K₂HPO₄, K₂CO₃, Na₂CO₃, hệ bị sẫm màu. Ngược lại, với hệ chứa hai muối có tính acid yếu là NaH₂PO₄ và (NH₄)SO₄ không quan sát thấy sự thay đổi màu này. Kết quả kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng cũng cho thấy

EGCG phân bố tốt lên pha giàu alcol đối với hệ ethanol/NaH₂PO₄ và ethanol/(NH₄)₂SO₄.

Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc muối

Thành phần pha		Đặc tính hình thành 2 pha
Ethanol	NaCl	Không tách pha, tủa muối
	KH2PO4	Không tách pha, tủa muối
	Na2SO4	Tách pha nhanh, không ổn định, tủa muối ở pha dưới
	NaH2PO4	Tách pha nhanh, ổn định
	(NH4)2SO4	Tách pha nhanh, ổn định
	Na3C6H5O7	Tách pha nhanh, ổn định
	K2HPO4	Tách pha nhanh, ổn định
	K2CO3	Tách pha nhanh, ổn định
	Na2CO3	Tách pha nhanh, ổn định

3.3. Xây dựng giản đồ pha

Giản đồ pha hệ ethanol/NaH2PO4 và hệ ethanol/(NH4)2SO4 được xây dựng bằng phần mềm OriginLab 8 (Hình 3.1). Đường tách pha chia giản đồ pha thành 2 vùng: vùng dưới đường tách pha là hệ một pha đồng nhất và không có sự tách lớp, vùng trên đường tách pha là vùng có sự tách lớp hình thành hai pha bền vững với pha trên là pha giàu alcol và pha dưới là pha giàu muối.

Hình 3.1. Giản đồ pha hệ ethanol và muối NaH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄

3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế cao thô bằng ATPS

3.4.1. Ảnh hưởng của loại muối

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại muối đến quá trình tinh chế

ATPS	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)	Tỷ lệ Vt/Vb
Ethanol/NaH2PO4	40,6 ± 0,7	15,7 ± 0,6	0,85
Ethanol/(NH4)2SO4	35,4 ± 1,0	22,4 ± 1,1	0,55

Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy: hệ ethanol/NaH₂PO₄ có tỷ lệ cao thu hồi cao hơn (40,6% so với 35,4%) và hàm lượng EGCG trong cao tinh chế thấp hơn so với hệ ethanol/(NH₄)₂SO₄ (15,7% so với 22,4%). Hệ ethanol/NaH₂PO₄ có tỷ lệ thể tích pha trên (V_t) và thể tích pha dưới (V_b) lớn hơn so với hệ ethanol/(NH₄)₂SO₄ (0,85 so với 0,55) nên tỷ lệ chất tan phân bố lên pha trên (pha giàu alcol) lớn hơn. Trong tinh chế các dịch chiết bằng phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng, tỷ lệ V_t/V_b thấp sẽ thuận lợi cho quá trình xử lý pha trên để thu sản phẩm do thể tích dịch tinh chế ít và nồng độ chất tan cao. Do đó, hệ ethanol/(NH₄)₂SO₄ được lựa chọn để khảo sát. 

3.4.2. Ảnh hường của tỷ lệ muối

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ muối đến quá trình tinh chế

Lượng muối (NH4)2SO4  (g)	Tỷ lệ muối (%)	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)
1,6	18	30,4 ± 0,8	24,2 ± 0,5
2,0	21	38,4 ± 1,2	21,9 ± 0,9
2,4	25	45,9 ± 0,9	20,6 ± 0,6
2,8	28	60,3 ± 1,1	15,7 ± 0,4

Từ kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, tăng tỷ lệ muối trong hệ làm tăng tỷ lệ cao thu hồi. Tuy nhiên, hàm lượng EGCG trong cao tinh chế giảm theo chiều tăng tỷ lệ muối trong hệ. Ở những tỷ lệ muối cao (28%), tỷ lệ cao thu hồi rất lớn làm giảm hiệu quả của quá trình tinh chế cao thô do hàm lượng EGCG trong cao không được cải thiện đáng kể. Ở tỷ lệ muối là 25%, cao tinh chế có hàm lượng EGCG cao (20,6%) và tỷ lệ cao thu hồi cao (45,9%) nên được lựa chọn. 

3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ alcol

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol đến quá trình tinh chế

Lượng ethanol (mL)	Tỷ lệ ethanol (%)	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)
1,5	13	25,6 ± 0,7	31,4 ± 0,9
2,0	17	30,9 ± 1,2	30,6 ± 0,8
2,5	20	45,9 ± 0,9	20,6 ± 0,6
3,0	23	54,1 ± 0,8	17,2 ± 0,5

Từ Bảng 3.4 nhận thấy, tăng tỷ lệ ethanol trong hệ từ 13 đến 23% làm tăng tỷ lệ cao thu hồi đồng thời làm giảm hàm lượng EGCG trong cao tinh chế. Điều này có thể được giải thích dựa vào ảnh hưởng của của tỷ lệ ethanol thêm vào hệ đến các đặc tính của hệ như Vt, Vb, tỷ lệ Vt/Vb, nồng độ ethanol trong pha giàu alcol. Tăng tỷ lệ ethanol trong hệ làm tăng Vt và nồng độ ethanol trong pha giàu alcol, do đó lượng chất tan phân bố lên pha trên tăng, tỷ lệ cao thu hồi tăng. Tuy nhiên, tỷ lệ cao thu hồi tăng có thể làm hàm lượng EGCG trong cao giảm khi tỷ lệ EGCG thu hồi giữ ở mức ổn định. Cân đối giữa 2 yếu tố tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao, tỷ lệ ethanol trong hệ là 17% được lựa chọn cho những khảo sát tiếp theo.

3.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đến quá trình tinh chế

Nồng độ dịch chiết (%)	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)
4	29,7 ± 0,8	29,6 ± 0,5
8	30,9 ± 1,2	30,6 ± 0,8
12	25,4 ± 0,4	27,2 ± 1,1
16	20,1 ± 0,6	26,4 ± 1,2

Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy, ở mức nồng độ dịch chiết thấp (4 và 8%), nồng độ dịch chiết ít ảnh hưởng đến tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao. Ở mức nồng độ dịch chiết cao (12 và 16%), tăng nồng độ dịch chiết làm giảm tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao. Điều này chứng tỏ, với một hệ ATPS cố định có khả năng tinh chế một tỷ lệ cao thô cố định. Do đó, nồng độ dịch chiết 8% được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.5. Ảnh hưởng của pH

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến quá trình tinh chế

pH	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)
3	29,0 ± 1,1	30,2 ± 0,6
4	30,1 ± 0,6	29,9 ± 0,7
5	26,3 ± 1,0	25,2 ± 0,8
6	23,3 ± 0,3	22,3 ± 0,5

 

Kết quả ở Bảng 3.6 chỉ ra rằng, khi pH của hệ trong khoảng 3-4, tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao tinh chế thay đổi không đáng kể. Tăng pH của hệ lên 5 và 6 làm giảm hàm lượng EGCG trong cao. Điều này có thể giải thích do các hoạt chất trong cao lá Chè xanh là các catechin có tính acid yếu, trong môi trường acid có pH < pKa, các catechin tồn tại phần lớn ở dạng phân tử nên dễ phân bố chủ yếu ở pha trên (pha giàu alcol ít phân cực hơn). Ngược lại, khi pH của hệ tăng, catechin tồn tại nhiều ở dạng ion hóa nên tăng nồng độ trong pha dưới (pha giàu muối), giảm nồng độ và sự phân bố trong pha giàu alcol, hệ quả là hàm lượng EGCG trong cao giảm. Trên cơ sở đó, pH tự nhiên của hệ được lựa chọn.

3.4.6. Ảnh hưởng của thời gian chiết phân bố

Với ATPS gồm các điều kiện: nồng độ dịch chiết 8%, tỷ lệ (NH4)2SO4 25% và tỷ lệ ethanol 17%, tiến hành xử lý mẫu như mô tả ở mục 2.3.4. với các thời gian chiết phân bố khác nhau từ 5 đến 20 phút nhận thấy: Ban đầu, tăng thời gian chiết phân bố làm tăng tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao, sau đó 2 chỉ số này được giữ hằng định theo thời gian (Bảng 3.7). Tại thời điểm 10 phút, cao tinh chế thu được có hàm lượng EGCG là 30,6% và tỷ lệ cao thu hồi là 30,9%. 

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết phân bố đến quá trình tinh chế

Thời gian (phút)	Tỷ lệ cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG (%)
5	27,4 ± 0,5	28,7 ± 0,4
10	30,9 ± 1,2	30,6 ± 0.8
15	29,5 ± 0,6	29,8 ± 0,6
20	30,2 ± 1,1	30,1 ± 0,5

3.4.7. Ảnh hưởng của loại cao thô

Với các điều kiện tinh chế bằng ATPS đã lựa chọn được, nghiên cứu thử nghiệm các loại cao thô ban đầu gồm cao nước (hàm lượng EGCG 10,5%) và cao ethanol 50%

(hàm lượng EGCG 15,3%) để kiểm tra khả năng tinh chế của ATPS ethanol/(NH4)2SO4. 

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của loại cao thô đến quá trình tinh chế

Loại cao thô	Hàm lượng EGCG trong cao thô (%)a	Tỷ lệ  cao thu hồi (%)	Hàm lượng EGCG trong cao tinh chế (%)b	Tỷ lệ tăng hàm lượng EGCGc
Cao thô nước	10,5 ± 0,3	30,9 ± 1,2	30,6 ± 0.8	2,9
Cao thô ethanol 50%	15,3 ± 0,5	40,4 ± 1,5	34,4 ± 1,1	2,2

*Tỷ lệ tăng hàm lượng EGCG: c = b/a.

Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, việc sử dụng cao thô ethanol 50% cho tỷ lệ cao thu hồi và hàm lượng EGCG trong cao tinh chế cao hơn so với việc sử dụng cao thô nước. Mặc dù hàm lượng EGCG trong cao thô ethanol 50% lớn hơn cao thô nước, tỷ lệ tăng hàm lượng EGCG trong cao tinh chế so với cao thô nước lớn hơn tỷ lệ tăng hàm lượng EGCG trong trường hợp cao thô ethanol 50% (2,9 so với 2,2). Điều này chứng tỏ bản chất cao thô ảnh hưởng đến quá trình tinh chế bằng ATPS và phương pháp tinh chế này hiệu quả với các cao thô lá Chè xanh chiết nước hơn là cao thô chiết bằng ethanol 50%, xét về tỷ lệ tăng hàm lượng hoạt chất trong cao.

Dựa vào các kết quả khảo sát trên, ATPS phù hợp cho quá trình tinh chế được lựa chọn gồm: loại alcol là ethanol, loại muối là (NH4)2SO4, nồng độ dịch chiết 8%, tỷ lệ muối 25%, tỷ lệ alcol 17%, pH 3-4, thời gian chiết phân bố 10 phút.

3.5. Quy trình điều chế cao lá Chè xanh giàu catechin

Sau các khảo sát trên, quy trình điều chế cao lá Chè xanh giàu catechin từ cao thô được xây dựng như sau:

• Sơ đồ quy trình:

• Mô tả quy trình:

Hòa tan muối (NH₄)₂SO₄ (48 g) và cao thô (8 g) vào 100 mL nước cất, kiểm tra pH và điều chỉnh trong khoảng pH 3-4 (nếu cần). Chuyển pha nước vào bình gạn 250 mL, thêm ethanol tuyệt đối (40 mL), lắc chiết phân bố trong 10 phút và để phân lớp. Chiết lấy lớp trên (~ 50 mL), tiếp tục thêm 100 mL ethanol tuyệt đối, lắc đều 5 phút, để phân lớp và gạn lấy lớp trên, Cô quay chân không thu hồi ethanol dưới áp suất giảm đến khi còn khoảng 15 mL, thêm đồng lượng nước và đông khô trên máy Christ Alpha 1-LD với các điều kiện: tiền đông mẫu ở -70^oC trong 12 giờ, đông khô 24 giờ ở điều kiện vận hành cố định của model 1-LD là nhiệt độ tiền đông -48 ± 2^oC, áp suất 0,120 ± 0,02 mbar.

Hình 3.2. Sắc ký đồ HPLC mẫu cao thô (trái) và cao tinh chế bằng ATPS (phải)

Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế được thể hiện ở Bảng 3.9.  Bảng 3.9. Kết quả phân tích các mẫu cao Chè

Mẫu cao Chè	Hàm lượng EGCG (%)	Tỷ lệ cao thu hồi (%)
Cao thô	10,5 ± 0,5	-
Cao tinh chế	29,2 ± 0,9	32,2 ± 1,3

4. Kết luận và kiến nghị Sau quá trình nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, cụ thể:

Đã xây dựng được quy trình điều chế cao giàu catechin từ cao thô lá Chè xanh sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng bằng hệ hai pha lỏng thân nước alcol/muối, các điều kiện chính gồm:

+ Nồng độ dịch chiết 8%, tỷ lệ (NH₄)₂SO₄: 25%, tỷ lệ ethanol: 17%, pH 3-4, thời gian chiết phân bố: 10 phút

+ Các bước tiến hành: chiết phân bố lỏng lỏng sử dụng hệ ethanol/(NH4)2SO4, thu lấy pha giàu ethanol, loại muối pha trên, cô thu hồi ethanol và đông khô.

Cao Chè tinh chế có hàm lượng EGCG 29,2 ± 0,9%.

Trên cơ sở các kết quả đã đạt được, đề tài có một số đề xuất sau:

• Nghiên cứu nâng quy mô quy trình tinh chế cao thô lá Chè xanh bằng ATPS ethanol/(NH₄)₂SO₄
• Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng sử dụng 2 pha thân nước trong chiết xuất và tinh chế các dược liệu khác.

Tài liệu tham khảo

1. Hoàng Văn Hoan (2014), Xây dựng và thử nghiệm quy trình công nghệ sản xuất nguyên liệu dược phẩm epigallocatechin gallat (EGCG) từ chè xanh, bộ công thương, mã số CNHD.ĐT.028/11-12.
2. Liu z. Q., et al. (2000), "Antioxidative effects of green tea polyphenols on free radical initiated and photosensitized peroxidation of human low density lipoprotein", Chemistry and Physics of Lipids, 106(1), pp. 53-63.
3. Wang h., et al. (2000), "Isocratic elution system for the determination of catechins, caffeine and gallic acid in green tea using HPLC", Food Chemistry, 68(1), pp. 115-121.