XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON 3 CỦA GEN EGFR TRÊN MẪU MÔ U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

Nguyễn Thị Thơm*, Nguyễn Thị Hòa*,  Phùng Thị Phương Chiêm*,

Dương T. Thu Liễu*, Hà Xuân Hợp**, Trần Quốc Đạt***,

Đặng Thị Ngọc Dung***, , Trần Vân Khánh***,   Kiều Đình Hùng***

*Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội, **BV Việt Đức Hà Nội , ***Trường Đại học Y Hà Nội,.

TÓM TẮT: Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định đột biến exon 3 của gen EGFR trên mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 60 mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm tại Khoa Giải Phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức.  Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp được áp dụng để xác định đột biến trên exon 3 của gen EGFR. Kết quả: 6/60 (10,0%) mẫu có đột biến điểm trên exon 3 gen EGFR với 2 kiểu đột biến khác nhau, trong đó 5/6 mẫu mang đột biến p.K129N, và 1/6 mẫu mang đột biến p.G87D. Kết luận: đã phát hiện được đột biến điểm trên exon 3 của gen EGFR trên mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm. Xác định đột biến gen EGFR sẽ giúp bác sỹ có định hướng điều trị phù hợp cho người bệnh.

Từ khoá: U nguyên bào thần kinh đệm, giải trình tự gen, gen EGFR.

SUMMARY

IDENTIFICATION EXON 3 OF EGFR GEN MUTATION

IN GLIOBLASTOMAS TISSUES

The aim of this study was to identify the mutation in exon 3 of the EGFR gene. Subjects and Methods: 60 tissues of glioblastomas were diagnosed 
at the Department of Pathology, Viet Duc Hospital. Direct sequencing method ware used to detect mutation in exon 3 of EGFR gene. 
Results: 6/60 (10,0%) of tissue were found to have mutation in EGFR gene, We found two different point mutations in EGFR gene, 
5/6 case was p.K129N mutation type; 1/6 was p.G87D mutation type. In conclusion: By using direct sequencing method, we successfully identified 
point mutation in exon 3 of EGFR gene. This results will help for doctor to give an appropriate treatment for glioblastomas patients.

Keywords: glioblastomas, sequencing, EGFR gene.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) - Glioblastoma (GB) phát triển từ tế bào thần kinh đệm trong não, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các loại u ác tính trong não (14,9%). Bệnh tiến triển rất nhanh, điều trị phẫu thuật là chủ yếu, và thời gian sống trên 5 năm rất thấp (dưới 5,5%) [1], [2]. Khoảng 40% – 50% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen EGFR và một số nghiên cứu đã chỉ ra đột biến gen EGFR có liên quan đến bệnh sinh, tỷ lệ sống còn của bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, hay gặp nhất là các đột biến xóa đoạn exon 2-7 và đột biến điểm trên các exon này. Tỉ lệ đột biến điểm exon 2-7 gen EGFR trên người mắc UNBTKĐ khoảng 14,4%, trong đó đột biến ở exon 2 là 0,8% ; exon 3 là 3,8%, exon 7 là 5,3%, exon 8 là 1,5% ; exon 15 là 2,2% ; exon 21 là 0,8%. Các đột biến đã được chứng minh phát sinh khối u bằng thử nghiệm trên chuột, và còn được ghi nhận tăng tính nhạy cảm với một số thuốc điều trị như Temozolomid [3] [4]… Vì vậy, xác định đột biến gen là cần thiết giúp bác sỹ lâm sàng tiên lượng bệnh và đưa ra được hướng điều trị tốt nhất cho bệnh nhân; tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về vấn đề này, do vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài với mục tiêu: Xác định đột biến exon 3 gen EGFR trên mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm.

II.  ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu: 60 mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm được thu thập tại Khoa Giải Phẫu Bệnh, Bệnh viện Việt Đức; được xác định là UNBTKĐ dựa trên kết quả giải phẫu bệnh theo tiêu chuẩn của WHO 2007.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

- Kỹ thuật tách DNA: các mẫu mô được loại bỏ paraffin bằng toluen, sau đó được tách DNA theo phương pháp phenol:chloroform. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được xác định trên máy Nano-Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 260/OD280 = 1,8 – 2,0 được sử dụng để phân tích.

- Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để khuếch đại exon 3 bằng cặp mồi đặc hiệu: Mồi xuôi: 5҆- TTAGGGTTCAACTGGGCGTC...-3҆;

Mồi ngược: 5҆- AGCCTTCTCCGAGGTGGAAT-3;

+ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10 μl) gồm:  5 μl Taq polymerase; 0,5μl mồi xuôi; 0,5μl mồi ngược; 1,0 μl DNA và 3 μl H₂O.

+ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94^oC/5 phút, 35 chu kỳ [95^oC/30 giây, 57^oC/30 giây, 72^oC/5 phút], 72^oC/5 phút. Bảo quản mẫu ở 15^oC.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, với điện thế 120V, trong 30 phút.

- Kỹ thuật giải trình tự gen

Sau khi khuyếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch, và sau đó được đưa vào giải trình tự bằng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự của gen EGFR hoang dại (wild type) trên GeneBank.

+ Thành phần mẫu giải trình tự (thể tích 10 µL) gồm: 6,5 µL H₂O; 1,5 µL Buffer Big dye 5X; 1 µL Big dye Terminator v3.1; 0,5 µL Mồi xuôi hoặc mồi ngược (10pmol/µL); 0,5 µL DNA tinh sạch.

+ Chu trình nhiệt: 96^oC/2 phút; 25 chu kỳ [96^oC/10 giây; 57^oC/5 giây; 60^oC/ 4 phút]. Bảo quản ở 15^oC.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu:  Sử dụng phần mềm thống kê y học SPSS 19.0; Phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1

2.4. Đạo đức trong nghiên cứu:

Đề tài tuân thủ tuyệt đối đạo đức nghiên cứu trong Y sinh. Đối tượng tham gia nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả sản phẩm PCR exon 3 gen EGFR

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại exon 3 gen EGFR, sản phẩm thu được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose, kết quả được trình bày ở hình 1:

 

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 3 gen EGFR của bệnh nhân UNBTKĐ. (+): mẫu đối chứng dương,  (-): Mẫu đối chứng âm (mẫu nước),  MK: Marker 100bp, GB1-GB9: Mẫu mô 1 đến 9.

Nhận xét: Mẫu đối chứng âm không có sản phẩm khuếch đại PCR chứng tỏ trong quá trình làm không bị nhiễm sản phẩm ngoại lai.

- Mỗi mẫu điện di chỉ cho 1 băng sáng duy nhất, rõ nét, không có các băng phụ, kích thước đồng đều và có chiều dài tương ứng với kích thước tính toán trên lý thuyết. Marker được phân tách rõ ràng cho phép nhận định kết quả chính xác. Như vậy phản ứng PCR đạt hiệu quả, sản phẩm PCR thu được đặc hiệu, đạt yêu cầu cho kỹ thuật giải trình tự gen.

3.2. Kết quả giải trình tự exon 3 gen EGFR

Exon 3 gen EGFR sau khi giải trình tự và so sánh kết quả với trình tự chuẩn trên GeneBank, kết quả phân tích được minh họa trên hình 2:

Bình thường                               Đột biến

Hình 2. Hình ảnh đột biến điểm p.G87D (A) và p.K129N  (B) trên exon 3 của  gen EGFR

Nhận xét: Có hai kiểu đột biến điểm trên exon 3 gen EGFR:

- Kiểu đột biến nucleoid G>A tại vị trí 259 trên c.DNA, làm thay đổi acid amin glycine có bộ ba mã hóa là GGT thành aspartate có bộ ba mã hóa là GAT tại vị trí 87 trên phân tử protein của EGFR (p.G87D).

- Kiểu đột biến nucleoid A>C tại vị trí 386 trên c.DNA, làm thay đổi acid amin lysine có bộ ba mã hóa là AAA thành arginine có bộ ba mã hóa là AAC tại vị trí 129 trên phân tử protein của EGFR (p.K129N)

Bảng 1. Các mẫu có đột biến điểm trên exon 3 gen EGFR

STT	Mã số	Exon	Thay đổi nucleotid	Thay đổi acid amin
1	GB4	3	c.386A>C	p.K129N
2	GB33	3	c. 386A>C	p.K129N
3	GB34	3	c. 386A>C	p.K129N
4	GB49	3	c. 259G>A	p.G87D
5	GB52	3	c. 386A>C	p.K129N
6	GB53	3	c. 386A>C	p.K129N

Nhận xét:

6/60 mẫu có đột biến điểm trên exon 3 gen EGFR chiếm tỉ lệ 10,0%; trong đó có 5/6 mẫu có kiểu đột biến là p.K129N, và 1/6 mẫu có kiểu đột biến là p.G87D.

IV. BÀN LUẬN

Nghiên cứu của chúng tôi đã tìm thấy 2 kiểu đột biến điểm trên exon 3 gen EGFR tương ứng với kiểu thay đổi trên phân tử protein của EGFR là p.G87D; và kiểu đột biến p.K129N. Cả hai kiểu đột biến đều là đột biến sai nghĩa làm thay đổi trình tự acid amin trên phân tử protein gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của phân tử protein, dẫn đến rối loạn hoạt động của tế bào. Nghiên cứu của Jeffrey C Lee, chỉ xác định được 1 kiểu đột biến trên exon 3 gen EGFR, tương ứng sự thay đổi trên protein EGFR là R108K của người bệnh UNBTK đệm và có 5 mẫu có kiểu đột biến này [4], số kiểu đột biến của chúng tôi tìm được nhiều hơn so với nghiên cứu của Jeffrey C Lee nhưng lại không giống ở vị trí đột biến.

Có 6/60 mẫu có đột biến, tỉ lệ đột biến chiếm khoảng 10,0%; tỉ lệ đột biến trên exon 3 gen EGFR tuy không cao nhưng so với nghiên cứu đã công bố thì tỉ lệ đột biến của chúng tôi lớn hơn, kết quả nghiên cứu của Jeffrey C Lee, có tỉ lệ đột biến exon 3 gen EGFR chỉ 3,8% [4].

Sự khác nhau về vị trí đột biến hay tỉ lệ đột biến do: các đột biến thường mang tính cá thể, có thể do tính đáp ứng của mỗi cá thể với tác nhân gây bệnh là khác nhau, trong ung thư phổi  hay ung thư vú các đột biến hay gặp ở vùng mã hóa protein EGFR vùng nội bào, còn ở UNBTKĐ thì các đột biến hay xảy ra ở vùng mã hóa cho protein EGFR ngoại bào, vị trí đột biến L858R ở exon 21 gen EGFR hay gặp trong ung thư phổi, hoặc trong ung thư vú, nhưng ở ung thư vú có thể gặp các kiểu đột biến khác nữa như G719S, G719A, G719C, S768I, L861Q… Các đột biến được quan sát thấy là độc lập với biểu hiện protein EGFR, qua xác định bằng cách nhuộm miễn dịch hóa học [5] [6]. Hoặc ngay trên người bệnh UNBTKĐ, có người có thể gặp đột biến exon 2 hoặc 3, hoặc 7… hoặc trên cùng exon 7 gen EGFR cũng có nhiều đột biến tại nhiều vị trí khác nhau, như T263P, A289V… và mỗi cá thể có thể sẽ có đột biến của 1 trong các exon trên các gen, vì vậy tỉ lệ đột biến trên từng exon có thể không cao: tỉ lệ đột biến gen EGFR trên người mắc UNBTKĐ ở exon 2 là 0,8% ; exon 3 là 3,8%, exon 7 là 5,3%, exon 8 là 1,5% ; exon 15 là 2,2% ; exon 21 là 0,8% [4]. Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên các mẫu mô sau phẫu thuật tại bệnh viện Việt Đức, địa điểm mổ u não lớn nhất của Miền Bắc, người bệnh chủ yếu tập trung ở các tỉnh phía Bắc của Việt Nam, tuy nhiên cũng không phải tất cả người mắc UNBTK đệm được khám và chữa bệnh hoặc được quản lý tại bệnh viện Việt Đức, do đó loại hình tổn thương đột biến có thể chưa mang tính đại diện cho người Việt Nam, nếu có thể nên mở rộng địa dư nghiên cứu như Miền Trung, Miền Nam Việt Nam.

Các nghiên cứu cũng ghi nhận đột biến gen trong UNBTKĐ có đáp ứng tốt hơn với một số hóa chất điều trị so với người không có đột biến, ví dụ Temozolomide, một chất kháng alkyl đang áp dụng điều trị mang lại kết quả tốt hơn, kéo dài thời gian sống hơn cho người bệnh [3] [4] [7]... Xác định đột biến gen trong bệnh UNBTKĐ là cần thiết, giúp thầy thuốc lâm sàng có thể tiên lượng hoặc áp dụng các phương pháp điều trị hiệu quả của các nước trên thế giới cho người bệnh tại Việt Nam.

V. KẾT LUẬN

Bằng kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp, đã xác định được đột biến exon 3 của gen EGFR trên mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm: 6/60 (10,0%) trường hợp có đột biến. Phát hiện được 2 loại đột biến điểm khác nhau, trong đó 5/6 trường hợp đột biến kiểu p.K129N, và 1/6 trường hợp đột biến kiểu p.G87D.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Cancer reseach UK (2011). Age-Standardised One-, Five- and Ten-Year Net Survival, Selected Cancers, Adults (Aged 15-99), England and Wales.
2. Quinn T. Ostrom, M.A., M.P.H. Barnholtz-Sloan, Ph.D (2016). Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009–2013. Neuro-Oncology, Volume 18, Issue suppl_5, 1, Pages v1–v75,
3. Shinojima N, Tada K, et al (2003). Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multi1forme. Cancer Res, 63(20), 6962–6970.
4. Jeffrey C Lee et al (2006). Epidermal Growth Factor Receptor Activation in Glioblastoma through Novel Missense Mutations in the Extracellular Domain.  journal.pmed 3(12), e485.
5. Tạ Thành Văn (2014). Xác định đột biến gen quyết định tính đáp ứng trong điều trị ung thư đại tràng và ung thư phổi, Đề tài cấp Nhà nước 2014.
6. Wen-Ming Cao, Yun Gao, and Xiao-Jia Wang (2015). Lack of epidermal growth factor receptor (EGFR)-activating mutations in triple-negative breast cancer in China. Breast Cancer Res, 17(1), 115.
7. Jigisha P. Thakkar, et al (2014). Epidemiologic and Molecular Prognostic Review of Glioblastoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 23(10), 1985–1996.