Nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong lá actiso (Cynara scolymus L.) bằng HPLC và góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu này
Ds. Nguyễn Thị Lan Anh, Ths. Ma Thị Hồng Nga, Ths. Nghiêm Thị Minh,
Ths. Trần Vũ Hoàng Anh, NguyễnThị Lượng – Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội;
Tóm tắt:
Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình định lượng acid chlorogenic trong lá actiso (Cynara scolymus L.) bằngHPLC. Tiến hành khảo sát nghiên cứu đã đưa ra được phương pháp xử lý mẫu tương đối đơn giản, ít gây mất mẫu bằng cách chiết với hỗn hợp dung môi methanol : nước tỷ lệ (60:40), ly tâm lấy dịch và lọc qua màng lọc 0,22 µm, để tiến hành sắc kí. Acid chlorogenic được định lượng với điều kiện cột Inertsil ODS (250 x 4,6mm, 5µm); nhiệt độ cột 25oC; Pha động: Acetonitril - dung dịch acid phosphoric 0,1% theo chương trình gradient; bước sóng phát hiện 330 nm. Phương pháp có khoảng tuyến tính trong khoảng từ 17,6 µg/ml – 52,9 µg/ml; độ nhạy cao với giới hạn định lượng 0,647 µg/ml. Ứng dụng phương pháp định lượng dược liệu actiso thu mua tại 3 miền kết quả cho thấy hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu thử rất khác nhau (hàm lượng acid chlorogenic từ 0,0273% đến 0,3172%).
Research on the quantification of chlorogenic acid in actis leaf (Cynara scolymus L.) by HPLC and contribute to standardize this medicinal plant.
Pharmacist. Nguyễn Thị Lan Anh, MA. Ma Thị Hồng Nga, MA. Nghiêm Thị Minh,
MA. Trần Vũ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Lượng – Hanoi medical college
Summary:
The study aimed to establish the chlorogenic acid process in actinic leaves (Cynara scolymus L.) by HPLC. Conducted study investigations have shown a relatively simple, less productive sample handling method by extraction with a mixture of methanol: water (60:40), centrifugal filtration and filtration 0.22 μm filter, for chromatography. Chlorogenic acid was quantified with an Inertsil ODS column (250 x 4.6 mm, 5 μm); column temperature 25oC; Mobile phase: Acetonitrile - 0.1% phosphoric acid solution under the gradient program; wavelength of detection 330 nm. The method has a linear range of 17.6 μg / ml - 52.9 μg / ml; High sensitivity to the quantitative limit of 0.647 μg / ml. Applying method of quantifying actiso pharmaceuticals in 3 regions showed that chlorogenic acid content in samples was very different (chlorogenic acid content from 0.0273% to 0.3172%).
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid chlorogeniccũng là hoạt chất có vai trò quan trọng trong actiso với nhiều tác dụng dược lý như chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u, kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp...[2]. Acid chlorogenic là chỉ tiêu được quy định trong chuyên luận dược liệu và cao actiso trong dược điển của nhiều nước như dược điển Anh, Châu Âu, Trung Quốc…Hàm lượng acid chlorogenic trong dược liệu actiso (lá khô) không ít hơn 0,8% [3]. Trong khi đó, Dược điển Việt Nam IV chưa có quy định về hàm lượng acid chlorogenic trong actiso. Để nâng cao tiêu chuẩn chất lượng vàhội nhập quốc tế đối với dược liệu (lá) và các bán thành phẩm, thành phẩm chứa actiso thì ngoài việc định lượng cynarin cần thiết phải kiểm soát một chất định danh có tác dụng dược lý làacid chlorogenic.
Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong lá actiso (Cynara scolymus L.) bằng HPLC và góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu này” với mục tiêu:
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu Actiso: gồm các mẫumua ở thành phố Hồ Chí Minh và Đà Lạt (Miền Nam), ở Huế và Quảng Nam (Miền Trung), ở Hà Nội và Sapa (Miền Bắc).
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Chất chuẩn
- Chất chuẩn: Acid chlorogenic (C16H18O9) hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS: 71121F của AK Scientific, TnC, Mỹ.
2.2.2. Hóa chất, dung môi:
- Acid phosphoric 85% loại PA của JTBaker, Mỹ; acetonitril và methanol loại HPLC của Merck, Đức.
2.2.3. Phương tiện,thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) AB204 (d = 0,1),cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ) XPE105 (d =0,01), máy siêu âm Daihan WUC - A06H, dụng cụ: các loại pipet, micropipet, bình định mức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), bình gạn (Đức), cốc có mỏ, vial,…Máy ly tâm Hermile 2306, tủ sấy Memmert ULM – 500
2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Khoa Dược, Trường cao đẳng Y tế Hà Nội.
- Phòng thí nghiệm trung tâm, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Xây dựng được quy trình định lượng acid chlorogenic trong dược liệu (lá) actiso bằng phương pháp HPLC
2.4.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
- Xử lý mẫu:Tham khảo tài liệu [1], tiến hành nghiên cứu quy trình xử lý mẫu: Lấy khoảng 50 g mẫu thử, sấy khô. Nghiền nhỏ. Rây qua rây 1400. Cân chính xác khoảng 1,00 g bột dược liệu vào ống falcon 50 ml, thêm 35 ml hỗn hợp methanol - nước tỷ lệ (60:40), siêu âm 15 phút; Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn lớp dịch chiết vào bình định mức 50 ml qua giấy lọc khô. Tráng ống falcon 3 lần với lần lượt 5 ml, 5 ml và 3 ml hỗn hợp methanol - nước tỷ lệ (60:40) và chuyển vào bình định mức trên qua giấy lọc, định mức đến vạch bằng hỗn hợp methanol - nước tỷ lệ (60:40).
Kiểm tra khả năng chiết kiệt acid chlorogenic trong mẫu bằng cách: Cho toàn bộ cắn và giấy lọc trên vào ống falcon, thêm 5 ml hỗn hợp methanol - nước tỷ lệ (60:40), siêu âm 15 phút; Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Lọc dịch trong qua màng lọc 0,22 μm. Tiến hành sắc ký. Kết quả không thấy xuất hiện pic tại vị trí ứng với thời gian lưu của acid chlorogenic (phụ lục 1). Do vậy, lựa chọn quy trình xử lý mẫu như trên.
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 18 mg acid chlorogenicchuẩn vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml methanol, siêu âm đến tan hoàn toàn. Thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml, thêm 25 ml methanol và pha loãng vừa đủ thể tích bằng nước, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,22 µm.
2.4.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Lựa chọn cột và tỷ lệ pha động:
Khảo sát các hệ pha động và tỷ lệ như sau:
- Hệ 1: MeCN và dung dịch acid acetic 0,1%, với tỷ lệ (30% - 70%).
- Hệ 2: MeCN và acid formic 0,1%, tỷ lệ (10% - 90%).
- Hệ 3: MeCN và dung dịch acid phosphoric 1,0%, với tỷ lệ (10% - 90%).
- Hệ 4: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,4%, với tỷ lệ (10% - 90%).
- Hệ 5: MeCN và dung dịch acid phosphoric 0,1%, với tỷ lệ thay đổi của MeCN từ 5 - 20% (DC = 5%).
Thực nghiệm trên mẫu chuẩn và mẫu thử.
Tốc độ dòng: Thay đổi tốc độ dòng để pic của acid chlorogenic tách tốt, pic cân đối, thời gian sắc ký phù hợp.
Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm để pic của acid chlorogenic tách tốt, pic cân đối, pic có đáp ứng (diện tích) phù hợp.
Bước sóng phân tích: Quét phổ của pic ứng với acid chlorogenic trong khoảng UV, lựa chọn bước sóng ứng với cực đại hấp thụ.
2.4.1.3. Thẩm định phương pháp
Xử lý mẫu theo qui trình đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ICH [4]. Đánh giá tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ của phương pháp: độ chọn lọc, độ phù hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại của phương pháp, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
2.4.2. Ứng dụng
Xác định hàm lượng acid chlorogenic trong một số mẫu Actiso đang lưu hành trên thị trường.
Đưa ra mức khuyến cáo về chỉ tiêu acid chlorogenic đối với dược liệu actiso trồng tại Việt Nam.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý dựa vào một số hàm trong Microsoft Excel.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng được quy trình định lượng acid chlorogenic trong dược liệu (lá) actiso bằng phương pháp HPLC
3.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Thực hiện trên cột C18, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện 330 nm.Khảo sát trên mẫu chuẩn acid chlorogenic (ACG).
Kết quả thể hiện hình 1
Hình 1. Sắc ký đồ tách chất phân tích với các hệ pha động hệ 5
Từ kết quả khảo sát trên với hệ pha động MeCN - acid phosphoric 0,1% với tỷ lệ dung môi 10% - 90% phù hợp để tách chất phân tích trong dung dịch chuẩn acid chlorogenic.
Khảo sát trên mẫu thử dược liệu actiso:
Tiến hành xử lý mẫu, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký với chương trình sắc ký trên, kết quả cho thấy giữa các lần tiêm mẫu sắc ký đồ không ổn định, có thể các chất chưa được rửa giải hết ở lần tiêm trước đó. Vì vậy, với tỷ lệ pha động lựa chọn theo cách rửa giải đẳng dòng không phù hợp để tách acid chlorogenic nên tiếp tục khảo sát chương trình rửa giải gradient, ảnh hưởng của nhiệt độ cột và tốc độ dòng.
Cố định thể tích tiêm 10µl, bước sóng phân tích 330nm, khảo sát chế độ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng theo 4 chương trình gradient. Lựa chọn được chương trình gradient như sau:
Bảng 1. Các hệ gradient tỷ lệ pha động và tốc độ dòng
Thời gian (phút)
A (%)
B
(%)
Tốc độ dòng
(ml/ phút)
B (%)
0 → 14
10
90
1,5
22,0→ 22,5
10 → 90
90 → 10
14,0→ 14,5
1,5 → 1,0
22,5→ 27,0
14,5→ 21,0
1,0
27,0→ 27,5
21,0→ 21,5
1 → 1,5
27,5→ 30,0
Quét phổ UV tại vị trí ứng với thời gian lưu pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ, sắc kí đồ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng nhau.
Thể tích mẫu thử: tiêm 5 µl và 10 µl mẫu thử vào hệ thống sắc ký. Kết quả thấy pic acid chlorogenic thu được khi tiêm 10 µl cho diện tích khoảng 1000 mAU.s gấp đôi diện tích pic khi tiêm 5 µl. Nên lựa chọn thể tích tiêm là 10 μ l.
3.1.2. Thẩm định phương pháp
3.1.2.1. Độ chọn lọc:
Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch sau: mẫu actiso, mẫu chuẩn, mẫu trắng (methanol 60%), mẫu thử thêm chuẩn được chuẩn bị như mục 2.4.1.1.
Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu thử có pic có cùng thời gian lưu với pic acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; pic ứng với acid chlorogenic trong sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn tăng lên, còn sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic ứng với thời gian lưu của acid chlorogenic. Tiến hành chồng phổ UV của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ của dung dịch thử và chuẩn, hệ số match thu được lần lượt là 999,98 và 1000,0. Độ tinh khiết của pic acid chlorogenic trên sắc ký đồ mẫu actiso là 999,751 cho thấy pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử là tinh khiết (hình 2)
Hình 2 Chồng phổ UV và tinh khiết píc của mẫu actiso
Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ chọn lọc.
Tiêm vào hệ thống sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn được chuẩn bị như mục 2.4.1.1.Kết quả ở bảng 4 cho thấy hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2,0%.
Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng chính xác để thu được dãy các dung dịch chuẩn trong hỗn hợp methanol: nước (60:40) có nồng độ acid chlorogenic là 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng (35 µg/ml). Tiến hành sắc ký. Kết quả được thể hiện ở Bảng 2
Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Nồng độ ACG (µg/ml)
0.0176
0.0282
0.0353
0.0423
0.0529
Diện tích pic (mAU.s)
499.3
777.6
1004.0
1179.8
1503.0
Phương trình hồi quy: y = 28474x + 11,208
Hệ số tương quan: 0.9994 Hệ số chắn: 1,12%
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ acid chlorogenic và diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan r = 0,9994.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Pha giống mẫu chuẩn phần tiến hành mục 2.4.1.1.
- Chuẩn bị dung dịch thử: Pha giống mẫu thử phần tiến hành mục 2.4.1.1. Mẫu thử có độ ẩm 8,16%.
Tiêm dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
* Kết quả:
- Xác định độ lặp lại bằng cách xác định hàm lượng hoạt chất trong 6 mẫu thử trong ngày. Tính RSD 6 kết quả của ngày phân tích thứ nhất.
- Xác định độ chính xác trung gian bằng cách xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử được thực hiện ở 2 ngày phân tích khác nhau. Tính RSD 12 kết quả của cả 2 ngày phân tích.
Kết quả ở bảng 6 cho thấy phương pháp có độ chính xác tốt với độ lặp lại trong ngày (n = 6) có RSD < 2,0% và độ chính xác trung gian (n=12) có RSD < 3,0%. Như vậy phương pháp có độ chính xác đạt yêu cầu.
-Chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm chuẩn vào mẫu thử với lượng mẫu tương ứng 50% lượng mẫu chuẩn bị dung dịch thử. Lượng chuẩn thêm vào sao cho hàm lượng ACG ở mức 70%; 100%; 130% so với nồng độ định lượng và chuẩn bị dung dịch sắc ký theo cách chuẩn bị mẫu thử. (Theo Bảng 3) (3 mức nồng độ mỗi nồng độ làm 3 lần).
Kết quả thực nghiệm cho thấy % thu hồi ở mỗi mức nồng độ từ 98,32% đến 100.99%, với độ lệch chuẩn tương đối ở 3 mức nồng độ đều nhỏ hơn 2,0%. Như vậy, phương pháp phân tích có độ đúng tốt đối với hoạt chất nghiên cứu trong mẫu dược liệu actiso.
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc lần lượt bằng MeOH 60% thành các dung dịch có nồng độ giảm dần 0,784 – 0,098 µg/ml. Tiến hành sắc ký. Nồng độ tại đó có tỷ lệ S/N khoảng 3 và bằng 10 được coi là LOD và LOQ của phương pháp.
Kết quả thu được cho thấy LOD và LOQ của phương pháp lần lượt là 0,196 µg/ml và 0,647 µg/ml.
Từ các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng các yêu cầu về độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác theo qui định của ICH; phương pháp có độ nhạy cao, khoảng làm việc là 70-130% nồng độ định lượng 35 µg/ml.
Định lượng acid chlorogenic trong actiso theo qui trình được trình bày trong mục 3.1.1, làm lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trên Bảng 3
Bảng 3. Kết quả định lượng acid chlorogenic trên mẫu cao actiso
Mẫu
Lượng cân thử (g)
Diện tích píc (mAU.s)
Độ ẩm %
Hàm lượng (%)
Trung bình (%), RSD %
Nơi mua
Theo miền
H1
1.0272
314.1
9.24
0.059
TB= 0.059%
44B Lãn Ông - Hà Nội
Miền Bắc
TB =
0.117%
RSD = 50,55%
1.0561
325.3
RSD= 1.32%
1.0102
303.6
0.058
H2
1.0299
1174.5
9.92
0.222
TB=0.222%
Chợ Sapa - Lào Cai
1.0183
1135.2
0.217
RSD=2.48%
1.0306
1207.6
0.228
H3
1.0303
504.1
10.03
0.095
TB = 0.094%
52 Lãn Ông - Hà Nội
1.0128
495.2
RSD = 1.50%
1.0062
479.3
0.093
H4
0.9940
476.9
10.47
0.094
54 Lãn Ông - Hà Nội
1.0008
488.4
RSD = 0.97%
0.9993
H5
1.0158
10.75
0.097
TB = 0.097%
69 B Lãn Ông - Hà Nội
1.0207
511.7
0.098
RSD = 1.02%
1.0185
500.2
0.096
T1
1.0044
161.2
8.17
0.031
TB = 0.030%
215 Bà Triệu - TP Huế
1.0016
153.2
0.029
RSD = 3.08%
1.0863
175.3
T2
1.0171
835.2
3.81
0.149
TB = 0.148%
127 Trần Hưng Đạo - TP Huế
1.0032
812.4
0.147
RSD = 0.76%
1.0618
861.2
T3
1.1145
786.6
6.23
0.132
TB = 0.140%
157 Trần Hưng Đạo - TP Huế
1.0387
758.1
0.136
RSD = 1.85%
1.1074
784.3
L1
1.0046
1398.1
7.21
0.263
TB = 0.260%
Quảng Nam
Miền Trung
TB = 0.177%
RSD = 65.92%
1.0021
1385.4
0.261
RSD = 0.86%
1.0285
1406.7
0.258
L2
1.0189
100.8
7.89
0.0188
TB = 0.019%
1.0036
102.6
0.0194
RSD = 2.60%
1.0432
108.9
0.0198
L3
0.9905
1652.6
7.96
0.317
TB = 0.313%
Chợ Đà Lạt
0.9973
1645.1
0.314
RSD = 1.34%
1.0052
1632.4
0.309
H6
1.0524
767.2
9.52
0.180
TB = 0.180%
1.0366
753.1
0.179
RSD = 0.63%
1.0178
748.6
0.181
H7
1.0430
482.9
8.79
0.113
TB = 0.113%
1.0216
467.3
0.112
RSD = 1.28%
1.0679
501.2
0.115
L4
1.0110
1017.6
8.16
0.192
TB = 0.192%
TP Hồ Chí Minh
Miền Nam
TB = 0.142%
RSD = 55.38%
1.0064
1000.9
0.190
RSD = 1.57%
1.0254
1052.0
0.196
H8
1.1025
131.9
9.46
TB = 0.029%
1.0921
127.6
RSD = 3.76%
1.0663
118.5
0.027
H9
599.4
10.20
0.148
1.0268
608.3
RSD = 0.59%
1.0435
625.3
H10
1.0245
831.8
9.23
0.199
TB = 0.199%
1.0228
828.6
RSD = 0.47%
1.0080
811.3
0.198
4.1.Kết luận
Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau:
Đã xây dựng được phương pháp định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Actiso bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau: cân chính xác 1,0g dược liệu, chiết siêu âm bằng methanol 60%. Các chất trong dung dịch mẫu thử được tách bằng cột C18 Inersil ODS (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) pha động gồm acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% chạy theo chế độ gradient, tốc độ dòng gradient, thể tích tiêm 10µl. Chất phân tích được phát hiện bằng detector UV.
Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu của ICH. Phương pháp có độ chọn lọc tốt, khoảng tuyến tính có hệ số tương quan xấp xỉ 1, độ chính xác trong ngày và giữa hai ngày đều đạt yêu cầu. Độ thu hồi đều nằm trong khoảng 98,0 - 102,0%. Phương pháp có độ nhạy cao với giới hạn định lượng 0,647 µg/ml.
Kết quả phân tích trên 17 mẫu dược liệu actiso mua trên thị trường tại 6 tỉnh thuộc miền Bắc, miền Trung, miền Nam cho thấy phương pháp đã xây dựng phù hợp để phân tích định lượng hoạt chất acid chlorogenic trong mẫu dược liệu actiso đã thẩm định nên có thể đưa chỉ tiêu định lượng acid chlorogenic vào tiêu chuẩn chất lượng của actiso.
Trên cơ sở nghiên cứu thực nghiệm và tính khả thi của phương pháp đã xây dựng chúng tôi đề xuất cần phải nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu đưa chỉ tiêu định lượng acid chlorogenic vào trong chuyên luận actiso.
Tài liệu tham khảo
1. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 79 - 81.
2. Phí Thị Bảo Thoa (2017), Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, Khóa luận dược sĩ, Đại học Dược HN.
3. Qing LI Y. J. et al. (2005), "Simultaneous Determination of Protocatechuic Acid, Syringin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Liriodendrin and Isofraxidin in Acanthopanax senticosus HARMS by HPLC-DAD", Biol. Pharm. Bull. (29 (3), pp. 532 - 534.
4. ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1).