TỔNG HỢP VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA DẪN XUẤT THIOPHEN CHỨA DỊ VÒNG 1,2,4-TRIAZOL VÀ 2-THIOXO-THIAZOLIDIN-4-ONE

Nguyễn Thị Nga, Vũ Quốc Trung, Nguyễn Ngọc Linh

Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Thị Minh Huệ

Tóm tắt : Từ acid 3-thiophen axetic qua ba bước để tổng hợp ra hai dẫn xuất chứa dị vòng 1,2,4-triazol và 2-thioxo-1,3-thiazolidine-4-one. Cấu trúc của các dẫn xuất đã tổng hợp được xác định dựa vào phổ IR, 1H-NMR và 13C-NMR.  Hai dẫn xuất  tổng hợp được có khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis  tại nồng độ tối thiểu 256 mg/ml.

1. Đặt  vấn đề

Các hợp chất của thiophen được quan tâm nhờ ứng dụng đa dạng trong đời sống. Trong kĩ thuật, các dẫn xuất của thiophen và polythiophen đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trên toàn thế giới, đầu tư vào các dự án công nghệ mới như điốt phát quang hữu cơ (OLEDs), tế bào quang điện hữu cơ (OPVs), pin mặt trời, cửa sổ thông minh,… cùng các ứng dụng trong cảm biến hóa học và sinh học. Trong y học, các hợp chất của thiophen được nghiên cứu làm thuốc như thuốc kháng sinh, thuốc chữa bệnh tiểu đường, thuốc tim mạch…[2], [3], [4].

 Hiện nay, ở Việt Nam, việc tổng hợp và nghiên cứu các hợp chất của thiophen mới chỉ ở giai đoạn bước đầu, chưa có nhiều công trình nghiên cứu.

        Xuất phát từ những yêu cầu lí luận và thực tiễn như trên, chúng tôi chọn đề tài: “Tổng hợp và thăm dò hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của dẫn xuất thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol và 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one”.

Mục tiêu của đề tài:

1 .Tổng hợp và xác định cấu trúc hai dẫn xuất thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol và 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one xuất phát từ axit 3-thiophen axetic.

2. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của hai  dẫn xuất thiophen chứa dị vòng đã tổng hợp.

2. Đối tượng và phương pháp

2.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu

-Đối tượng nghiên cứu:  Dẫn xuất thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol và 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one  xuất phát từ axit 3-thiophen axetic.   

-Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm – Bộ môn Hóa – Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội. Bộ môn Hóa Hữu cơ – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Viện Hóa học – Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3. Hóa chất, dụng cụ và các chủng vi sinh vật

* Hóa chất

- Axit 3-thiophen axetic, metanol (Sigma Aldrich, 99%),  hiđrazin hiđrat (Merck, 98%),  cacbon đisunfua,  axit clohiđric, kali hiđroxit, natri hiđroxit, đietyl ete, MgSO₄ khan.

- Bột silica gel cho sắc kí cột 100-200(Merck), bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm Art.5554DC-Alufolien Kisel 60 F254 (Merck).

- Chất xúc tác: axit sunfuric đặc, axit axetic .

- Dung môi: etanol, metanol, nước cất,  etylaxetat, aceton, dietyl ete, toluene

- Thuốc: Ampicilin, Cefotaxim, Nystatin

 - Tất cả thuốc thử và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.

* Dụng cụ:

- Cốc thủy tinh và bình cầu các loại: 50 ml, 100ml và 250ml.

- Sinh hàn, phễu lọc hút chân không, nhiệt kế, đũa thủy tinh,…

- Con từ, máy khuấy từ gia nhiệt, máy sấy khô, máy đo nhiệt độ nóng chảy.

*Thiết bị xác định cấu trúc

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp của Anh.

- Máy đo phổ IR Impact 410-Nicolet.

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):  Bruker – XL500 – Đức.

  * Các chủng vi sinh vật kiểm định

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người: Bacillus subtilis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 13709),  Lactobacillus fermentum (N4), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): ), Salmonella  enterica, Candida albicans (ATCC 10231)

 -Môi trường nuôi cấy : MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp tổng hợp và nghiên cứu cấu trúc  một số dẫn xuất thiophen xuất phát từ axit   3-thiophen axetic

- Tổng hợp hai dẫn xuất thiophen từ  axit 3-thiophen axetic bằng phương pháp hóa học theo sơ đồ sau:

Sơ đồ2.1. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol và

2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one

- Tổng hợp metyl 2-(thiophen-3-yl)axetat (54)

Đun hồi lưu hỗn hợp gồm 4,26g  (0,03 mol ) axit 3-thiophen axetic hòa tan trong 10 ml metanol với 3–4 giọt axit H₂SO₄ đặc trong 24h ở 70⁰C. Hỗn hợp sau phản ứng được chưng cất loại dung môi, chiết bằng đietyl ete. Dung dịch chứa sản phẩm được làm khô bằng MgSO₄ khan, loại bỏ ete thông qua cất quay chân không ở 40⁰C, thu được 4,21 g (0,027 mol) chất lỏng.

-  Tổng hợp 2-(thiophen-3-yl)axetohiđrazit (55)

Hòa tan 0,78g (5 mmol)  este 54, 2g (40 mmol) hiđrazin hiđrat (N₂H₄.H₂O) trong 5 ml etanol, đun hồi lưu 6h ở 70⁰C. Dung dịch sau phản ứng được đuổi bớt dung môi, kết tinh trong nước đá. Sản phẩm rắn tách ra được lọc, rửa bằng etanol lạnh, sau đó kết tinh lại nhiều lần trong etanol đến khi có nhiệt độ nóng chảy ổn định, thu được 0,62 gam (3,97mmol) hiđrazit.

-  Tổng hợp thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol (56)

Hòa tan 0,78g (5 mmol ) hiđrazit 55 vào hỗn hợp dung dịch chứa 0,56g (0,01 mol) KOH trong 10 ml etanol, sau đó thêm tiếp 0,76g ( 0,01 mol ) cacbon đisunfua. Khuấy đều hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 5h đến khi không còn khí H₂S sinh ra. Chất rắn màu vàng tách ra được lọc và rửa bằng đietyl ete. Tiếp đó, chất rắn được hòa tan vào 10 ml nước cùng 0,75g (15 mmol) hiđrazin hiđrat và đun hồi lưu trong 8h ở 80⁰C. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh, axit hoá bằng axit axetic loãng đến khi xuất hiện chất rắn màu vàng. Lọc thu lấy chất rắn, rửa và kết tinh lại trong hỗn hợp etanol–nước (4:1), thu được 0,79 gam (3,73mmol)   hợp chất 56

-  Tổng hợp thiophen chứa dị vòng 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one (57)

Hòa tan 1,56 (10 mmol ) hiđrazit 55 vào 5 ml etanol, sau đó thêm tiếp2,26g (10 mmol )axit thiocacbonyl-bis-thioglycolic. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 8h ở 80^oC. Sản phẩm rắn tách ra được lọc, rửa và kết tinh lại trong etanol, thu được 1,66 gam (6,1mol) chất rắn 57

-Nghiên cứu cấu trúc của dẫn xuất thiophen chứa dị vòng (56) và (57) dựa vào

Nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):

2.4.2.Thăm dò hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất thiophen chứa dị vòng (56) và (57)

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng độ trên môi trường lỏng thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế) [5], [6]

*  Pha loãng mẫu thử

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 256mg/ml.

*  Thử hoạt tính

Lấy 10ml dung dịch mẫu thử  ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200ml dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ  5.10⁵CFU/ml, ủ ở 37^oC/24h.

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất không chuyển hoá MTT thành MTT formazan cho màu tím đậm.

*  Chất tham khảo

- Kháng sinh Ampicillin( MIC :0,004 – 1,20 mg/ml), Cefotaxim (MIC: 0,07 – 19,23 mg/ml), Nystatin (MIC :2,8- 5,0 mg/ml.)

3. Kết quả và bàn luận

3.1.1 Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metyl 2-(thiophen-3-yl)axetat (54)

-Sản phẩm este 54 dạng dung dịch màu vàng nâu. Hiệu suất đạt 90%

-Phổ IR: 1735 cm^–1 (C=O ), 3104 cm^–1 (C–H vòng thiophen ), 2999–2952 cm^–1 (C–H no ). Phổ ¹H-NMR : H2 :δ = 7,32 ppm (double-double, J_4–2 = 1Hz, J_5–2 = 2Hz), H4 :δ = 7,03 ppm (doublet, J_5–4  = 5Hz) ,H5 :δ = 7,47 ppm (double-double, J_4–5 = 5, J_2–5 = 3). H6  :3,69 ppm. CH₃ singlet 3,62 ppm

Như vậy, qua việc khảo sát phổ IR và ¹H-NMR, chúng tôi cho rằng phản ứng đã xảy ra este hóa đã xảy ra và metyl 2-(thiophen-3-yl)axetat (54) thu được có cấu tạo như dự kiến.

3.1.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của 2-(thiophen-3-yl)axetohiđrazit (55)

- Sản phẩm thu được là chất rắn, dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy thấp, hiệu suất 80%.

- Phổ IR : 1641 cm^–1 (C=O),  2957 cm^–1( C–H no) , 3068 cm^–1 (C–H trong vòng thiophen ), 3323 cm^–  (–NH₂  ), 3068 cm^–1 (NH). Phổ ¹H-NMR của : H2 :δ = 7,22 ppm (double-double J_4–2 = 1Hz, J_5–2 = 2Hz). H4 : (δ = 7,01 ppm) , H5 có δ = 7,43 ppm (double-double, J_2–5 = 3Hz, J_4–5 = 4,5Hz).  H6 :δ = 3,32 ppm singlet , H9 :δ = 4,20 ppm (singlet). H8 :δ = 9,14 ppm (singlet). Trên phổ ¹³C-NMR: C7:169,17 ppm , C6 :δ = 35,10 ppm, C3 :δ = 135,95 ppm, C2 :δ = 122,06 ppm , C5 (δ = 125,99 ppm)

Như vậy, các số liệu về phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã xác nhận sản phẩm thu được là 2-(thiophen-3-yl)axetohiđrazit (55).

3.1.3. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazole (56)

- Hợp chất 56 ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 105⁰C, hiệu suất 70%.

- Trên phổ ¹H-NMR: H2 : δ = 7,33 ppm (multiplet), H4 (δ = 7,06 ppm) , H5: δ = 7,49 ppm  double-double ,J_4-5 = 5, J_2-5 = 3. H8 singlet (δ = 13,54 ppm). H6 δ = 3,54 ppm (singlet). Trên phổ ¹³C-NMR : C6 (δ = 25,60 ppm). C9 (166,47 ppm,  C7 (δ = 151,55 ppm), C3 (δ = 135,61 ppm) , C2 (δ = 123,30 ppm) , C5 (δ = 126,67 ppm)

Như vậy, các số liệu về nhiệt độ nóng chảy, phổ IR và NMR đã xác nhận sản phẩm thu được là thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol 56.

3.1.4. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của thiophen chứa dị vòng 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one (57)

- Sản phẩm 57 ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 99 ⁰C, hiệu suất 61%

Phổ IR của 57 :1727 cm^–1 ,1684 cm^–1 (C=O), 2965–2921 cm^–1 (C–H no) , 3148 cm^–1 (C–H trong vòng thiophen) , 1244–1177 cm^–1 (C=S) ,  1532 cm^– (C=C).

Phổ ¹H-NMR : H2 : δ = 7,35 ppm (double). H4 :(δ = 7,08 ppm) , H5 : (δ = 7,50 ppm) double-double với hằng số tách J_2–5 = 3, J_4–5 = 4,5. H8 :11,19 ppm. H6: δ = 3,69 ppm ,  H10 :δ = 4,42 ppm.  Phổ ¹³C-NMR của 57 : C6 :δ = 33,62 . C10 : δ = 34,67 ppm,  C11: 200,25 ppm , C3 :δ = 134,38 ppm ,  C2:  δ = 123,09 ppm C5 : δ = 126,18 ppm

Như vậy, các số liệu về nhiệt độ nóng chảy, phổ IR và NMR đã xác nhận sản phẩm thu được là thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol 57.

3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của hợp chất (56) và (57)

 

Bảng 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm của hợp chất (56), (57)

Mẫu	Giá trị MIC đối với các chủng vi sinh vật (mg/ml.)
	Gram (+)			Gram (-)			Nấm
	Staphylococcus aureus	Bacillus subtilis	Lactobacillus fermentum	Salmonella enterica	Escherichia coli	Pseudomonas aeruginosa	Candida albican
56	256	256	>256	>256	>256	>256	>256
57	256	256	>256	>256	>256	>256	>256

 

Nhận xét:  Mẫu thử  (56 ) và  (57)có hoạt tính trên các chủng vi sinh vật kiểm định Gram   (+) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis  với giá trị MIC là 256 mg/ml. 

Bàn luận: Các hợp chất (56) và (57) mới có khung dị vòng  còn đơn giản so với các hợp chất kháng  sinh đối chứng  nên hoạt tính sinh học yếu. Quan nghiên cứu các tài liệu chúng tôi thấy rằng có thể thêm các nhóm thế  như nitro, phenyl vào các dị vòng thì có thể tăng được các hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 

4.Kết luận

- Đã nghiên cứu được quy trình tổng hợp hai dẫn xuất mới của thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol (56) đạt hiệu suất 70%  và 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one (57) đạt hiệu suất 61% . Hai dẫn xuất (56), (57) cùng với các dẫn xuất trung gian của quá trình tổng hợp (54), (55) đã được xác định nhiệt độ nóng chảy và xác định cấu trúc chính xác dựa vào các bộ phổ ¹H-NMR , ¹³C-NMR, IR.

- Đã thăm dò hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của hai  dẫn xuất thiophen chứa dị vòng (56) và (57). Kết quả cho thấy hợp chất (56) và (57) có hoạt tính yếu trên các chủng vi sinh vật kiểm định Gram   (+) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis  với giá trị MIC là 256 mg/ml

5. Kiến nghị

Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy việc tổng hợp hai dẫn xuất thiophen chứa dị vòng 1,2,4-triazol  và 2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one có hiệu suất tương đối cao lần lượt là 70% và 61%. Hai hợp chất này có thể tăng cường hoạt tính sinh học bằng cách thêm những nhóm thế phenyl hoặc các nhóm thế như nitro đồng thời cũng có thể tiếp tục nghiên cứu theo hướng tổng hợp polime dẫn. Vì vậy chúng tôi kiến nghị cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn về các dẫn chất chứa dị vòng và thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn chất này để làm  phong phú thêm kho dược chất của nhân loại và hướng đến những ứng dụng thực tiễn cao hơn của các hợp chất dị vòng.

Summary

Synthesize and probe antifungal, antibacterial activity of thiophene derivative containing 1,2,4-triazole heterocyclic and

2-thioxo-1,3-thiazolidine-4-one heterocyclic

          Starting acid 3-thiophen axetic. , two derivatives containing heterocyclics 1,2,4-triazol  and  2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one  synthesized. Their structure have been determined by IR, 1H-NMR and 13C-NMR spectral data. The researching of biological activity showed that the complex is able to inhibit the growth of pathogenic bacteria species: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis  in concentrations 256 mg/ml.

Keywords: 3-thiophen axetic, heterocyclics 1,2,4-triazol , heterocyclics  2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-one  

 

Tài liệu tham khảo

* Tài liệu tham khảo tiếng Việt

[1]. Trần Quốc Sơn (2011), Cơ sở hóa học dị vòng, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm

* Tài liệu tham khảo tiếng Anh

 [2]. Herland A., Nilsson K. P. R., Olsson J. D. M., Hammarstrom P., Konradsson P. and Inganas O. (2005), Synthesis of a regioregular zwitterionic conjugated oligoelectrolyte, usable as an optical probe for detection of amyloid fibrillation at acidic pH, J. Am. Chem. Soc., 127, 2317-2323.

 [3]. Issa M.I. Fakhr, Mohamed A.A. Radwan, Seham El-Batran, Omar M.E. Abd El-Salam, Siham M. El-Shenawy (2009), Synthesis and pharmacological evaluation of 2-substituted benzo[b]thiophenes as anti-inflammatory and analgesic agents, European Journal of Medicinal Chemistry 44, 1718-1725

 [4]. Monika Wujec, Monika Pitucha, Maria Dobosz, Urszula Kosikowska and Anna Malm (2004), Systhesis and potential antimycotic activity of 4-substituted-3-(thiophene-2-yl-methyl)-Δ²-1,2,4-triazoline-5-thiones, Acta Pharm, 54, 251-260

 [5]. Hadacek, F., Greger, H. (2000), “Test of antifungal natural products methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem. Anal., 90, 137-147.

 [6]. Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco  Sindambiwe, Arnold J. Vlietinck, Dirk Vanden Berghe; “Bioassay for antibacterial and antifungal activities”; Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium,1-13 (2005).