NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRONG BỆNH
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM
* Thành viên tham gia: Nguyễn Thị Thơm (trường Cao đẳng Y tế Hà nội), Phùng Thị Phương Chiêm (trường Cao đẳng Y tế hà nội), Trần Văn Khôi (trường Cao đẳng Y tế Hà nội), Nguyễn Thị Dung (trường Cao đẳng Y tế Hà nội), Dương Thị Thu Liễu (trường Cao đẳng Y tế Hà nội).
Tóm tắt: U nguyên bào thần kinh đệm (GB) là loại u ác tính trong não, tiến triển rất nhanh, điều trị ít hiệu quả, bệnh nhân mắc GB thường tử vong sau phẫu thuật khoảng 6 tháng đến 1 năm, nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh chưa được xác định rõ. Nhằm xác định liên quan đột biến gen EGFR với bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, chúng tôi thực hiện đề tài với Mục tiêu: Xác định tình trạng đột biến exon 2, 7, 8 gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu 30 mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm lấy tại khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen trực tiếp bằng máy tự động để xác định đột biến các exon 2, 7, 8 gen EGFR. Kết quả: 6/30 mẫu u nguyên bào thần kinh đệm (tỉ lệ 20%) có đột biến điểm trên exon 2 và 7 gen EGFR; trong số các đột biến có 33,3% mang đột biến kiểu p. G42D và 22,2% mang đột biến kiểu p. A289T. Kết luận: Bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen trực tiếp đã phát hiện được đột biến trên exon 2,7 gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm với tỉ lệ là 20% (6/30 mẫu); trong số các đột biến có 33,3% mang đột biến kiểu p. G42D và 22,2% mang đột biến kiểu p. A289T, chưa thấy có đột biến trên exon 8 gen EGFR. Xác định được đột biến có thể giúp bác sỹ tiên lượng bệnh và định hướng điều trị tốt hơn cho người bệnh.
Từ khoá: U nguyên bào thần kinh đệm, PCR, đột biến exon 2,7 gen EGFR,.
1. Đặt vấn đề:
U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB/GBM) là một loại u ác tính trong não, chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại u thần kinh đệm (62,7%). Chẩn đoán xác định u nguyên bào thần kinh đệm bằng hình ảnh mô bệnh học, các tế bào của u có nguồn gốc phôi thai giảm biệt hoá tăng sản. Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với nhiều giai đoạn trung gian giữa 2 loại tế bào. Tính biệt hoá thấp, tạo sự giảm thiểu các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái [1-2].
Bệnh u nguyên bào thần kinh đệm ác tính tiến triển nhanh, điều trị ít hiệu quả, thời gian sống thêm của bệnh nhân GB sau mổ trung bình chỉ 6 tháng đến 1 năm [1] [2]; do đó rất nhiều nhà khoa học đã và vẫn đang tập trung nghiên cứu sâu về chẩn đoán, bệnh sinh GB nhằm tìm ra những hướng điều trị mới cứu sống bệnh nhân.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan của đột biến gen với căn bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, và đã tìm thấy sự biến đổi một số gen trong đó có EGFR là gen có tỷ lệ đột biến khá cao (khoảng 46%) [3]. Gen EGFR qui định một loại thụ thể (Receptor) liên kết trên bề mặt tế bào trong nhóm các yếu tố phát triển thần kinh – bì. Receptor này khi được gắn với chất hoạt hóa sẽ biến đổi thành dạng hoạt động kích hoạt quá trình tyrosin phosphoryl hóa, khởi động quá trình khuếch đại tín hiệu kích thích tổng hợp DNA và nhân lên của tế bào. Nếu xảy ra đột biến EGFR, thụ thể hoạt động quá mức sẽ dẫn đến tế bào nhân lên không kiểm soát kích hoạt quá trình hình thành khối u. Hay gặp nhất là các đột biến xóa đoạn exon 2-7 và đột biến điểm trên các exon này. Các đột biến sẽ ảnh hưởng chủ yếu đến hoạt động vùng ngoại bào của phân tử EGFR, nơi xảy ra tương tác với các phối tử của chúng. Đây là những đột biến làm tăng ái lực của EGFR với các thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase loại 2. Chính vì vậy các loại thuốc này sẽ có hiệu quả hướng đích trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen EGFR [3] [4]. Hiện nay, thuốc ức chế ung thư qua EGFR được chứng minh hiệu quả trên nhiều ung thư ở các cơ quan khác nhau liên quan đến đột biến gen EGFR, như ung thư phổi, vú, đại tràng... [5]. Do đó, phân tích gen ngoài việc xác định thể đột biến, tiên lượng, tư vấn nguy cơ mắc GB, về tương lai nhóm nghiên cứu mong muốn còn có thể hỗ trợ chỉ định điều trị đích với trường hợp đột biến EGFR, bằng cách kết hợp sử dụng thuốc ức chế EGFR cùng các phương pháp điều trị khác. Điều này sẽ giúp kiểm soát ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khả năng sống sót cho bệnh nhân GB [3][4][6].
Các nghiên cứu về u nguyên bào thần kinh đệm trong nước mới chỉ dừng lại ở tỷ lệ mắc, tỷ lệ sống còn, hiệu quả một số phương pháp điều trị… nhưng chưa có nghiên cứu về đột biến gen EGFR.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Xác định tình trạng đột biến exon 2-7 gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
- 30 mẫu mô được xác định bằng hình ảnh trên tiêu bản mô bệnh học là u nguyên bào thần kinh đệm, tại khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức, trên tiêu bản không có hình ảnh của một u nào khác, các mẫu mô được bảo quản trong paraffin.
- Nghiên cứu được thực hiện tại trung tâm Gen – Protein trường Đại học Y Hà nội từ 5/2016 – 5/2017;
- Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang
- Các bước tiến hành nghiên cứu:
+ Thu thập mẫu mô nghiên cứu
+ Tách DNA từ mô đúc paraffin theo phương pháp phenol:chloroform
+ PCR khuếch đại các exon 2,7,8 bằng các cặp mồi đặc hiệu,
+ Điện di sản phẩm PCR để kiểm tra sản phẩm sau khuếch đại các exon, và xác định xóa đoạn exon.
+ Giải trình tự các exon 2,7,8 trực tiếp bằng máy ABI-3100 Genetic Analyzer.
+ Đọc kết quả giải trình tự bằng phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1, để xác định các kiểu đột biến điểm.
3. Kết quả và bàn luận
3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch DNA sau tách chiết
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch DNA sau tách chiết
Mẫu mô (Mã BN)
Nồng độ DNA
(ng/µl)
Độ tinh sạch (A260/A280)
Mẫu mô
(Mã BN)
GB1
69.9
2.00
GB16
33.7
1.94
GB2
28.6
1.97
GB17
96.0
GB3
GB18
43.8
2.01
GB4
66.5
2.04
GB19
43.6
1.95
GB5
43.7
GB20
137.1
1.99
GB6
50.2
GB21
91.0
2.03
GB7
65.8
2.07
GB22
40.2
GB8
66.6
GB23
28.3
1.89
GB9
36.2
1.91
GB24
33.6
1.85
GB10
117.4
1.87
GB25
55.4
GB11
82.3
GB26
41.2
GB12
59.5
GB27
48.7
GB13
54.0
1.96
GB28
70.2
GB14
GB29
81.8
1.93
GB15
229.3
1.88
GB30
45.8
Sau tách chiết DNA là bước kiểm tra về số lượng và chất lượng sản phẩm, để đảm bảo lượng DNA cho việc làm kỹ thuật PCR tiếp theo thì quan trọng nhất là phải có DNA sau tách chiết, nồng độ DNA không nhất thiết phải là quá cao, vì phương pháp PCR ưu điểm ở chỗ chỉ cần một lượng DNA rất nhỏ đã có thể khuếch đại được một sản phẩm rất lớn sau các chu trình, theo các nghiên cứu được thực hiện trước thì nồng độ DNA khuôn chỉ cần khoảng 25 đến 95ng/µl. 30 mẫu DNA của chúng tôi đủ điều kiện cho khuếch đại PCR.
Hình 3.1. Ảnh đo nồng độ DNA sau tách DNA
Chất lượng của DNA là độ tinh sạch, nghĩa là DNA thu được sau tách chiết hạn chế tối đa nhiễm các tạp chất, vì tạp chất có thể ảnh hưởng đến việc khuếch đại của phản ứng PCR, gây ức chế bắt cặp giữa mồi và đoạn gen cần nhân bản. Độ tinh sạch cần đạt được tính theo tỉ lệ A260/A280 là 1.8 -2,0. A260 là mật độ quang đo được của DNA ở bước sóng 260nm, gọi là đỉnh hấp thụ của DNA; A280 là mật độ quang đo được của protein ở bước sóng 280nm, gọi là đỉnh hấp thụ của protein. Các mẫu trong nhiên cứu của chúng tôi hầu hết đều đạt độ tinh sạch cao, và các mẫu này đạt tiêu chuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR.
3.2. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm DNA sau chạy PCR.
9 mẫu khuếch đại exon 2 của các GB 3, 4, 5, 10, 12, 14, 15, 17, và 28 không có hình ảnh băng điện di hiện lên sau chạy điện di, chúng tôi đã tiến hành làm lại phản ứng PCR cho 9 mẫu này, để kiểm tra sai số của kết quả. Kết quả làm lại không thay đổi. Các mẫu này được làm cùng các mẫu chứng dương, chứng âm, kết quả của 3 lần làm là giống nhau, đều không có sản phẩm PCR. Chúng tôi kiểm tra mẫu khuôn DNA ban đầu sau tách DNA, thấy nồng độ mẫu và độ tinh sạch của mẫu vẫn đảm bảo điều kiện để khuếch đại gen bằng PCR. Kết quả sản phẩm của các exon 7 hoặc 8 của các mẫu này vẫn có. Do vậy kết luận của chúng tôi là có đột biến xóa đoạn exon 2 gen EGFR của 9 mẫu trên. Tuy rằng theo báo cáo của một số nghiên cứu thì thông thường với gen EGFR đột biến xóa đoạn hay gặp là xóa từ exon 2 đến 7 gen EGFR [3] [6]. Nhưng các nghiên cứu này đều thăm dò xóa đoạn theo phương pháp FISH, khác với phương pháp của chúng tôi là khuếch đại từng exon. Theo Frederick L, đột biến trên gen EGFR có nhiều kiểu xóa đoạn; thường xóa D6-273 (67%); ngoài ra còn nhiều kiểu xóa khác như: D6-185; D521-603; D958-1030 [6].
3.3. Kết quả giải trình tự exon 2,7, 8 gen EGFR
Sau khi đọc kết quả giải trình tự, chúng tôi đã tìm thấy một số đột biến sau:
Bảng 3.2. Các kiểu đột biến điểm exon 2,7 gen EGFR
STT
Mã BN
Exon
Thay đổi nucleotid
Vị trí – kí hiệu a.a thay đổi
Tên a.a thay đổi
1
2
c.371 G > A
P. G42D
Glycine → Aspartat
3
c.430 C > A
P. L62I
Leucine → Isoleucine
4
5
7
c.1032 C > T
p. D262D
Aspartat → Aspartat
6
c.1067 C > T
c.1123 A > T
p.T 274M
p. K293X
Threonine → Methionine
Lysine → termination
c.1111 G > A
p. A289T
Alanine → Threonine
8
Kết quả có 6/30 mẫu có đột biến điểm, chiếm 20%; 1/30 mẫu có 3 điểm đột biến; 1/30 mẫu có 2 điểm đột biến, còn lại 4/30 mẫu có 1 điểm đột biến.
Hình 3.4. Ảnh đột biến trên exon 7 mẫu GB26, GB27 gen EGFR
Jeffrey C Lee và cộng sự (2006), nghiên cứu 151 mẫu GB tại Mỹ, kết quả: exon 2 có các đột biến p.D46N và p.G63R; exon7 có các đột biến kiểu: p.T263P; p. A289T (1mẫu); p. A289V (3 mẫu); p. A289D (1 mẫu); tại vị trí codon 289 rất hay xảy ra đột biến và có nhiều kiểu đột biến, nhưng trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ có 1 kiểu đột biến p.A289T và có 2 mẫu có đột biến kiểu này, nhiều hơn 1 mẫu so với nghiên cứu của Jeffrey C Lee, là đột biến sai nghĩa gây thay đổi về kiểu hình; còn lại các đột biến điểm khác không giống với nghiên cứu của Jeffrey C Lee. Chúng tôi cho rằng có thể số mẫu nghiên cứu của chúng tôi còn ít (30 mẫu); và dân tộc, màu da hay vị trí địa lý có thể gây sự sai khác trong vị trí của đột biến trên exon 2,7 gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. (hầu hết những người mắc GB trong nghiên cứu của Jeffrey C Lee là người gốc Bắc Âu); nhưng sự sai khác vị trí không cách nhau quá xa, ví dụ: p.G42D so với p.D46N và p.L62I so với p.G63R [4].
Như vậy, vị trí điểm đột biến trên exon 2 và 7 cũng có thể xảy ra tại nhiều vị trí khác nhau, và đã được chứng minh có liên quan đến sự hình thành, phát sinh khối u ung thư, và một số đột biến có nhạy cảm với thuốc điều trị đích [4] [6]. Chưa phát hiện thấy có đột biến exon 8 gen EGFR trong nghiên cứu của chúng tôi.
4. Kết luận và kiến nghị
- Nghiên cứu 30 mẫu mô u nguyên bào thần kinh đệm, bằng cách khuếch đại gen và giải trình tự gen đã phát hiện có 30% đột biến xóa đoạn exon 2; 20% có đột biến điểm trên exon 2 và 7 gen EGFR, chưa phát hiện có đột biến trên exon 8 gen EGFR.
- Đề nghị mở rộng nghiên cứu để xác định đầy đủ hơn về các kiểu đột biến gen EGFR và tìm mối liên quan của đột biến với đặc điểm lâm sàng và kết quả điều trị, để tìm hướng điều trị tốt nhất cho người bệnh.
Study EGFR gene mutation in glioblastomas
Abstract: Studying 30 tissue samples of glioblastomas was collected at the Department of Pathology, Viet Duc Hospital, which determined the mutation status in exon 2-7 of EGFR gene. The results show that there were 30% deletion mutation in exon 2 of EGFR gene, 20% was the percentage of point mutations in exon 2 and 7 of EGFR gene.
Tài liệu tham khảo