SƠ BỘ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY AN XOA  (Helicteres hirsuta Loureiro)

Lê Thị Hải Yến; Nguyễn Thị Nga; Nguyễn Thị Quyên;

Phạm Thị Hằng Nga; Lưu Thị Bích Ngọc

 

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sơ bộ xác định được thành phần hóa học trong cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro) thu hái ở Bình Phước có đường khử, terpenoid, coumarin, tanin và flavonoid. Hàm lượng polyphenol toàn phần tính theo acid galic trong mẫu khô kiệt là 0,3667%.Phân đoạn dịch chiết cloroform từ cây An xoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư mạnh trên các dòng: ung thư biểu bì miệng KB (IC₅₀ = 9,22 µg/ml); ung thư gan Hep G2 (IC₅₀ = 15,7µg/ml);  ung thư phổi LU-1 (IC₅₀ = 11,2 µg/ml).Tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 tương đối yếu (IC₅₀ = 78,7 µg/ml).

Từ khóa: cây An xoa, Helicteres hirsuta Loureiro, ức chế tế bào ung thư.

1.Đặt vấn đề

Ung thư hiện nay đang là một trong những nguyên nhân gây tử vong cao nhất trên thế giới.  Ở nước ta thường gặp nhất là ung thư: phổi, vú, đại trực tràng, dạ dày, gan, tiền liệt tuyến, tử cung/cổ tử cung, thực quản, bàng quang, u lympho không hodgkin, khoang miệng, bệnh bạch cầu, tụy, buồng trứng và thận. Phần lớn các bệnh nhân ung thư (khoảng 70%) chỉ đến bệnh viện điều trị khi đã quá muộn, khiến cho cơ hội chữa khỏi bệnh rất thấp. Theo thống kê gần đây, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư ở Việt Nam là 35% [3].

Bên cạnh với việc điều trị ung thư bằng ngoại khoa, hóa trị, xạ trị..., ngày nay nhiều nhà khoa học còn hướng tới tìm kiếm và sử dụng các cây thuốc với mục đích phòng, hỗ trợ và điều trị ung thư. Nhiều dược liệu đã được chứng minh có tác dụng ức chế, tiêu diệt tế bào ung thư mạnh như: cây thông đỏ, trinh nữ hoàng cung, dừa cạn, nghệ vàng, tam thất bắc... [2], [5].

Cây an xoa (tổ kén cái, Helicteres hirsuta Lour. thuộc họ Trôm) mọc rất phổ biến ở ven rừng, bãi hoang khắp Việt Nam và các nước châu Á, có tác dụng chữa ung nhọt, tiêu độc [1] và gây độc tế bào ung thư trên thực nghiệm[7]. Tuy nhiên cho đến nay, nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của Helicteres hirsuta Lour. vẫn còn hạn chế.

 Góp phần nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của dược liệu này, mục tiêu đề tài chúng tôi đặt ra là:     

1. Sơ bộ nghiên cứu  thành phần hóa học của cây An xoa

2. Đánh giá tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư của cây An xoa trên thực nghiệm

II.Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu

Dược liệu: Cây trồng ở Bình Phước, thu hái 10/2015, được GS.TS. Phan Kế Lộc – khoa Sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội giám định khẳng định mẫu là cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro).

Dược liệu tươi loại bỏ quả và rễ rồi rửa sạch, sấy khô ở 100⁰C trong tủ sấy. Xay thành bột thô (40,00g) rồi tiết hành chiết và chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo sơ đồ 1.

Sơ đồ 1: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm từ dược liệu An xoa

Các dòng tế bào ung thư: đạt tiêu chuẩn quốc tế có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: Ung thư biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17^TM); Ung thư gan Hep G2 (HB - 8065^TM); Ung thư phổi LU-1 (HTB - 57^TM); Ung thư vú MCF-7 (HTB - 22^TM).

  Nghiên cứu tiến hành tại bộ môn Hóa – trường Cao đẳng Y tế Hà Nội và phòng Hóa sinh Ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Hóa chất, dụng cụ và các dòng tế bào ung thư

* Hoá chất, dụng cụ: Tất cả thuốc thử và các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích.

       - n-hexan; cloroform; methanol; nước cất ; gelatin 5%; FeCl₃ 5%; NH₃

       - Thuốc thử: Fehling;  Dragendoff (KBiI₄); Bouchardat (I­₂/KI); Mayer; Diazo (acid sulfanilic); ninhydrin 0,2%

* Dụng cụ: Máy quang phổ Genios Tecan của Nhật.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học của cây An xoa

Các nhóm chất được khảo sát trong dịch chiết: dung dịch 1; 2; 3 và 6 bằng phương pháp hóa học với thuốc thử đặc trưng.

Sử dụng sắc ký lớp mỏng để phát hiện hợp chất phenolic với thuốc hiện FeCl₃ 5%, quan sát dưới ánh sáng thường. Flavonoid: dùng thuốc hiện hỗn hợp dung dịch acid boric 10% trong ethanol: acid oxalic 10% trong ethanol (tỉ lệ 2:1); sấy ở 105⁰C và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn tử ngoại 366nm.

Định lượng polyphenol toàn phần theo phương pháp Folin-Ciocalteu. Polyphenol phản ứng với thuốc thử Folin (dung dịch màu vàng của polyphosphatetungstenate và molydate) trong môi trường kiềm yếu tạo thành màu xanh đậm.

• Cân khoảng 1-2g dược liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ, ngâm trong 10ml methanol 80%. Siêu âm 30 phút, lọc vào bình định  mức 50ml. Làm lặp lại 3 lần để thu dịch lọc. Tráng bã nhiều lần bằng methanol, lọc và định mức đủ 50ml. Sau đó cô đặc toàn bộ dung dịch và hòa tan trong bình định mức 5ml.

- Lấy 0,1ml mẫu (sử dụng nước cất làm mẫu trắng) được cho vào bình định mức 10ml. Sau đó thêm 0,5ml thuốc thử Folin và 9,3ml dung dịch Na₂CO₃ 2%.  Lắc đều và thêm nước vào đến vạch và ủ ở 40⁰C trong vòng 1 giờ. Sau đó dung dịch được đo ở bước sóng 760nm bằng máy đo quang phổ UV-1800 Shimadzu của Nhật.

Lượng polyphenol toàn phần được tính dựa vào độ hấp phụ của mẫu hợp chất và mẫu có acid galic làm chất chuẩn. Kết quả định lượng polyphenol toàn phần được quy về acid galic.

Trong đó:

C_s: Nồng độ chất so sánh (mg/ml)                    A_s: Độ hấp phụ của dung dịch so sánh

C_x: Nồng độ phenolic trong mẫu (mg/ml)        A_x: Độ hấp phụ của dung dịch mẫu

m_x: Khối lượng mẫu (mg)                                 H%: Hàm lượng phenolic

a%: độ ẩm             

2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế  một số dòng tế bào ung thư của cây An xoa

* Chuẩn bị thí nghiệm: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO₂, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37⁰C, vô trùng tuyệt đối) và được cấy chuyển 1-2 lần trước khi thí nghiệm. Tế bào phát triển ở pha log (logarid – pha có vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh theo cấp lũy thừa) sẽ được sử dụng để thử độc tính.

*Tiến hành thí nghiệm: Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào. Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5x10⁴ tế bào/ml tùy theo từng dòng tế bào).

          - Mẫu thử: mẫu được hòa tan bằng dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide) với nồng độ ban đầu là 20 mg/ml. Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/ml. Nồng độ chất thử trong đĩa  thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0.5 µg/ml. Chất tham chiếu Ellipticine pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM.

- Lấy vào mỗi giếng 10 µl chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µl dung dịch tế bào. Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy. Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ. Mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µl MTT (3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) 5 mg/ml trong 4h. Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µl DMSO 100%.

        - Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Genios Tecan. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

* Phương pháp xử lý số liệu: Giá trị IC₅₀ được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata.

% ức chế tế bào = (OD_{chứng (+)} – OD_{mẫu thử})/( OD_{chứng (+)}– OD_{chứng (-)}) x 100

          

(Trong đó, High_Conc/Low_Conc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; High_Inh%/Low_Inh%: % ức chế  ở nồng độ cao/% ức chế  ở nồng độ thấp ).

Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD) [4],[6].

III.Kết quả và bàn luận

3.1. Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học của cây An xoa

Kết quả sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học các nhóm chất cơ bản của cây an xoa bằng phương pháp hóa học được thể hiện ở bảng 1.

Bảng 1: Kết quả xác định thành phần hóa học của cây An xoa

TT	Nhóm chất	Kết quả định tính trong các dung dịch				Kết luận sơ bộ
		1	2	3	6
1	Đường khử - Phản ứng Fehling	++	-	++	++	Có
2	Terpinoid - Phản ứng với H2SO4 đặc	+	-	+	+	Có
3	Alcaloid -  Phản ứng Mayer -  Phản ứng Dragendorff -  Phản ứng Bouchardat	-	-	-	-	Không
4	Coumarin - Phản ứng Diazo - Phản ứng mở vòng lacton	++	-	++	+	Có
5	Tanin - Phản ứng víi FeCl3 5% - Phản ứng gelatin 5%	+	-	-	+	Có
6	Acid amin TT ninhydrin	-	-	-	-	Không
7	Flavonoid - Phản ứng Cyanidin - Phản ứng với NH3	++	-	++	+	Có

Ghi chú: Dung dịch 1: dung môi methanol; dung dịch 2: dung môi n-hexan;

               dung dịch 3: dung môi cloroform; dung dịch 6: dung môi nước

Định tính bằng phương pháp hóa học, chúng tôi phát hiện được có 5 nhóm chất hóa học cơ bản trong mẫu nghiên cứu là: đường khử; terpinoid; coumarin, tanin và flavonoid.

          Hình 1 và 2 là sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: ethyl acetat: aceton: acid formic =5:2:2:1.

A: Hình ảnh quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254nm

B: Hình ảnh quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm

C: Hình ảnh quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm sau khi phun thuốc thử

Kết quả cho thấy trong mẫu An xoa có nhóm flavonid và phenolic.

Kết quả định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần được thể hiện ở bảng 2:

Bảng 2: Kết quả định lượng polyphenol toàn phần

Mẫu	m(mg)	C(mg/ml)	A	H%
Acid galic	5,2	1,04	0,6655
1	1020,7	0,6954	0,445	0,3406
2	1592,2	1,0439	0,668	0,3278
3	1825,0	1,2017	0,769	0,3292
Trung bình				0,3325

Phần trăm trung bình sau ba lần đo tính được khối lượng polyphenol toàn phần trong mẫu thử khi chưa tính độ ẩm là 0,3325%.Vì độ ẩm mẫu đo được là 9,32%, nên tính được hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu là 0,3667%.

3.2.  Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của dịch chiết cây An xoa

          Để đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các phân đoạn chiết cây An xoa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ở 3 mẫu thử với tế bào ung thư biểu bì miệng. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.

Bảng 3: Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu bì miệng KB (CCL-17^TM)

STT	Tên mẫu thử	Giá trị IC50(µg/ml)
1	Mẫu I	>128
2	Mẫu II	9,22
3	Mẫu III	66,56
4	Chất tham khảo: Ellipticine	0,28

       Mẫu II là cắn thu được ở phân đoạn chiết bằng cloroform có giá trị IC₅₀ = 9,22(µg/ml) đáng quan tâm. Vì theo phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư nếu giá trị IC₅₀ ≤ 20 µg/ml (với dịch chiết thô) và IC₅₀ ≤ 20 µM  (với chất sạch) được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào đáng quan tâm, có khả năng ức chế hoặc diệt tế bào ung thư[4].

         Nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Young-Won Chin và cộng sự [7] xác định với cắn chiết bằng cloroform từ cây Helicteres hirsuta Lour. có tác dụng ức chế tế bào ung thư tuyến tiền liệt người là IC₅₀ = 9,1 µg/ml. Tác giả cũng xác định được trong dịch chiết từ thân cây An xoa có 6 lignan là  (±)pinoresinol; (±)syringaresinol; (-)-boehmenan; (-)boehmenan H và (±)trans – dihydrodiconiferyl alchol. Trong đó các chất: (±)pinoresinol; (-)-boehmenan và (-) boehmenan H có tác dụng ức chế tế bào ung thư mạnh trên các dòng ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư nội mạc tĩnh mạch rốn.

         Các lignan có khả năng tan trong nước, methanol, tan tốt trong cloroform và không tan trong n-hexan. Vì vậy phần cắn chiết bằng cloroform có tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu bì mạnh nhất (IC₅₀ = 9,22µg/ml) trong nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với nghiên cứu được công bố[6].

         Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư của mẫu II trên các dòng tế bào ung thư gan; ung thư phổi và ung thư vú, kết quả thể hiện ở bảng 4

Bảng 4: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào ung thư

của dịch chiết cây an xoa

STT	Tên mẫu	Giá trị IC50(µg/ml)
		Hep G2	Lu-1	MCF-7
1	Mẫu II	15,7	11,2	78,7
2	Chất tam chiếu: Ellipticine	0,25	0,36	0,5

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết cloroform của Helicteres hirsuta Lour. có tác dụng ức chế khá mạnh tế bào ung thư gan Hep G2 (IC₅₀ = 15,7 µg/ml) và tế bào ung thư phổi Lu-1 (IC₅₀ = 11,2 µg/ml). Tuy nhiên trên tế bào ung thư vú MCF-7 tác dụng ức chế của  dịch chiết yếu (IC₅₀ = 78,7µg/ml). Điều này có thể lý giải vì dịch chiết của chúng tôi còn thô nên xác định tác dụng ức chế trên tế bào ung thư vú có kết quả thấp, khác với nghiên cứu của Young-Won Chin và cộng sự đã phân lập được chất tinh khiết là (±)pinoresinol trong thân cây Helicteres hirsuta Lour. có IC₅₀ = 1,7µg/ml[6].

Nghiên cứu của chúng tôi phần nào làm sáng tỏ việc sử dụng cây An xoa Helicteres hirsuta Lour. trong dân gian với mục đích hỗ trợ điều trị ung thư gan, tuy nhiên vẫn cần phải có những nghiên cứu sâu hơn.

IV.Kết luận

Mẫu cây An xoa được chúng tôi thu hái tại Bình Phước vào tháng 10 năm 2015 còn gọi là tổ kén cái, tên khoa học là Helicteres hirsuta Lour.

- Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học, chúng tôi đã xác định được trong dịch chiết của cây An xoa có chứa đường khử, terpenoid, coumarin, tanin và flavonoid. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu khô là 0,3667%.

- Phân đoạn chiết bằng cloroform từ cây An xoa có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư biểu bì  IC₅₀ = 9,22(µg/ml); ung thư gan IC₅₀ = 15,7(µg/ml); ung thư phổi IC₅₀ = 11,2(µg/ml) và tác dụng yếu trên tế bào ung thư vú MCF-7 IC₅₀ = 78,7µg/ml.

V.Kiến nghị

Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy dịch chiết từ cây An xoa  (Helicteres hirsuta Lour.) có tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu bì, ung thư gan và ung thư phổi ở nồng độ thấp (IC₅₀ = 9,22 – 15,7 µg/ml) là đáng quan tâm. Vì vậy chúng tôi kiến nghị cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của cây An xoa để góp phần phát triển nền dược liệu nước nhà.

Summary

Research on Chemical Composition and Inhibitory effect some Cancer Cell Lines of Heliteres hirsuta Loureiro

This research, we have identified in the extract of Helicteres hirsuta Lour. from Binh Phuoc – Viet Nam have glucose, terpenoid, coumarin, tanin and flavonoid. Total polyphenol content of galic acid in the sample calculated as 0.3667% dried. Segment chloroform extraction from Helicteres hirsuta Lour. have the strong effect of inhibiting some cancer cell:  KB (IC₅₀ = 9.22 µg/ml); (Hep G2 IC₅₀ = 15.7µg/ml);  LU-1 (IC₅₀ = 11.2 µg/ml), weak effect on MCF-7 (IC₅₀ = 78.7 µg/ml).

Keywords: Helicteres hirsuta Lour.; inhibiting cancer cell; KB; Hep G2; LU-1, MCF-7.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 [1].Võ Văn Chi (2013),

      Từ điển cây thuốc việt nam, tập 2 (bộ mới), Nhà xuất bản Y học, trang 1011.

[2]. Đỗ Tất Lợi (2014),

      Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (In lần thứ 18), Nhà xuất bản Hồng Đức, Hà Nội.

[3]. Hoàng Thùy (2013),

       Phương pháp phát hiện sớm bệnh ung thư, Nhà xuất bản Thời đại.

[4].Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R. (1988),

    “Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines”, Cancer Reseach. Vol.48: 4827-4833.

[5]. Savithramma Naturu, Yugandhar Pulicherla, Bhumi Gaddala (2014),    

“A Review on medicinal plants as a potential source for cancer”, Intermational Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Volume 26(1), May-Jun 2014, pages 235-248.

[6].Young-Won Chin  illiam P. Jones, Ismail Rachman, Soedarsono Riswan, Leonardus B.S. Kardono, Hee-Byung Chai, Norman R. Farnsworth, Geoffrey A. Cordell, Steven M. Swanson, John M. Cassady  and A. Douglas Kinghorn; (2006),

      “Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in Indonesia”, Phytotherapy Research, Volume 20, Issue 1, January 2006, pages 62–65.