NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TP53 TRÊN BỆNH NHÂN

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM (GLIOBLASTOMA)

CN. Trần Văn Khôi, Ths. Nguyễn Thị Thơm,

Ths. Nguyễn Thị Nga CN. Phùng Thị Phương Chiêm

Tóm tắt: U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma-GB) là một trong các khối u não, Theo (WHO) phân loại Glioblastoma như một u tế bào hình sao (Astrocytoma) cấp IV với độ ác tính cao nhất. Gen TP53 là gen ức chế khối u có 11 exon trong đó exon 2-11 mã hoá protein dài 393 acid amin, các nghiên cứu trước đây thấy rằng bệnh nhân GB có tỉ lệ đột biến gen TP53 cao xấp xỉ 40%, đa số đột biến thường gặp trong vùng exon 5-8 từ 126 đến 306 acid amin. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định các kiểu đột biến gen TP 53 và bước đầu xây dựng quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen TP53 trên bệnh nhân GB [1].

1. ĐẶT VẤN ĐỀ.

U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma-GB) là một trong các khối u não phổ biến, theo WHO phân loại GB như một u nguyên bào hình sao cấp IV.

TP53 là gen áp chế khối u, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính ổn định của bộ gen, khi hoạt động, TP53 có tác dụng sửa chữa thương tổn DNA, thúc đẩy sự chết tế bào khi thương tổn DNA không thể sửa chữa. Tỷ lệ đột biến gen TP53 trong u nguyên bào thần kinh dao động từ 30% đến 35%, tỷ lệ này cao hơn trong các khối u thứ phát và phát triển từ u thần kinh đệm có mức độ ác tính thấp hơn [3]. Các dạng đột biến gen TP53 được chứng minh có vai trò quan trọng đối với quá trình tiến triển và xâm lấm của ung thư [3].

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu về trạng thái các gen biến đổi trong GB với mục tiêu:

• Bước đầu xây dựng quy trình xác định đột biến gen TP53 trên bệnh nhân Glioblastoma.
• Xác định đột biến gen TP53 trong u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma). 

 

 

 

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
   1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.
      1. Mẫu mô bệnh học 20 bệnh nhân được chẩn đoán xác định Glioblastoma, tại khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Việt Đức. Phân tích gen tại Trung tâm Gen – Protein – Trường Đại học Y Hà Nội.
      2. Quy trình nghiên cứu như sau : Mẫu mô paraffin- tách chiết DNA-PCR khuyếch đại exon 8 – giải trình tự gen- phân tích gen.
   2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
      1. Tách chiết DNA:
         1. Theo quy trình [1,2].

• Cạo phần ung thư đã được khoanh vùng từ lam paraffin slide
• Thêm 1ml Toluen, Votex, Li tâm 15000 v/3-5 phút, loại bỏ dịch nổi
• Thêm 1ml Ethanol 100%, Votex, Li tâm 15000v/ 3-5 phút
• Loại bỏ dịch nổi. Để khô cặn 56 độ C
• Thêm 650 µl Lysis buffer HD + 5µl Protein K
• Ủ 56 độ C
• Thêm 500 ml PCI (25:24:1).
• Vontex, ly tâm 15000 v/20 phút/4^oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
• Thêm 500 ml CI (24:1).
• Vontex, ly tâm 15000 v/10 phút/4^oC, sau đó thu lớp trên trong suốt.
• Thêm: 1000 ml ethanol 100% và 40 ml CH3COONa 3M, sau đó lắc đều và để ở -20^oC trong 2 giờ.
  1. 1. 2. PCR khuyếch đại đoạn gen chứa exon 8 dùng cặp mồi [4].

Exons 8, 9  Mồi xuôi 5′-GACAAGGGTGGTTGGGAGTAG-3′56

                            Mồi ngược 5′-CCAGGAGCCATTGTCTTTGAG-3′

 

 

 

 

Thành phần phản ứng gồm:

STT	Thành phần	Thể tích
1	Nước cất 2 lần	1μl
2	GOLTAQ 2x	5 μl
3	Mồi xuôi (2,5 pmol/ μl)	1,5μl
4	Mồi ngược (2,5 pmol/ μl)	1,5μl
5	DNA (50 ng/ μl)	1 μl
	Tổng thể tích	10.0 μl

Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy geneAmp PCR system 9700 (Applied  Biosystems, Hoa Kỳ). Bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 94⁰C trong 5 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 98⁰C trong 30 giây, gắn mồi ở 57⁰C trong 30 giây, kéo dài ở 72⁰C trong 30 giây, Kéo dài tổng hợp chuỗi DNA ở 72⁰C trong 5 phút.

Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR:

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Prigraph (Atto, Nhật bản) với thang chuẩn Ready – LoadTM 1 Kb Plus DNA Ladder.

Giải trình tự gen chứa exon 8:

Sử dụng kit BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, máy sử dụng ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer được phát triển bởi Applied Biosystems, USA, phân tích gen bằng phần mềm CLC Main Workbench và phân tích kết quả giải trình tự với gen gốc trên cơ sở dữ liệu gen.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.
   1. Kết quả tách chiết DNA.

Mẫu mô	Nồng độ DNA (ng/µl)	Độ tinh sạch (A260/A280)	Mẫu mô	Nồng độ DNA (ng/µl)	Độ tinh sạch (A260/A280)
GB1	727,3	1,9	GB11	875,3	1,91
GB2	1575,4	1,97	GB12	1323,4	1,94
GB3	900,8	1,96	GB13	1248,5	2
GB4	1437,1	2	GB14	402,3	1,96
GB5	364,1	1,94	GB15	2026,1	1,99
GB6	2312,8	1,92	GB16	2180	2
GB7	206	1,93	GB17	1714,4	1,83
GB8	1147,2	1,95	GB18	871,7	1,99
GB9	498,9	1,92	GB19	243,4	1,94
GB10	198,9	1,82	GB20	685	1,96

 

Nhận xét: DNA được tách chiết từ mẫu mô được đo bằng máy quang phổ nano Drop 1000 ở các bước song 260 nm và 280 nm, kết quả thu được như sau, hàm lượng DNA chiết tách được từ 206 – 2312.8 ng/µl trung bình là 1046.93 ng/µl, tỉ số OD_260nm/280nm = 1,82 – 2, trung bình là 1.94 ng/µl. Như vậy sản phẩm tách chiết DNA được sử dụng cho các kĩ thuật PCR và PCR lồng là đạt yêu cầu.

3.2 Kết quả PCR

Nhận xét: Băng điện di rõ nét, đúng kích thước, không có sản phẩm phụ. Phản ứng PCR đã khuyếch đại được các đoạn DNA đích.

1. 3. Kết quả giải trình tự gen.

Phát hiện 3 đột biến điểm

Bệnh nhân GB16:

Nhận xét: Bệnh nhân GB16 xác định được một đột biến điểm, đột biến tại vị trí Nucleotid 18,722 tại codon264. Đột biến T > G, biến đổi A;T > C:G, thay đổi acid amin Leucin (CTA) > Agrinin (CGA), là loại đột biến sai nghĩa.

Bệnh nhân GB17:

Nhận xét: Bệnh nhân GB17 xác định được một đột biến dị hợp tử, đột biến tại vị trí Nucleotid 18,778 tại codon283. Đột biến C > G,biến đổi C:G>G:C biến đổi acid amin Agrinin (CGC) > Glycin (GGC), đột biến sai nghĩa.

Bệnh nhân GB18:

Nhận xét: Bệnh nhân GB18 xác định được một đột biến dị hợp tử, đột biến tại vị trí Nucleotid 18,763 tại codon278. Đột biến C > G, biến đổi C:G>G:C,biến đổi acid amin Proline(CCT) > Alanin(GCT), đột biến sai nghĩa.

4. BÀN LUẬN.
   1. Xây dựng quy trình xác định đột biến exon 8 gen TP53.

Xét nghiệm gen TP53 điển hình bao gồm: Giải trình tự DNA tất cả các exon và chỗ nối intron - exon [7]. Các đột biến vùng intron có vị trí bên trong hoặc gần chỗ nối intron-exon có thể ảnh hưởng đến sự chính xác của việc cắt nối mRNA.. Theo kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đã áp dụng thành công quy trình xác định đột biến exon 8 của gen TP53 bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp. Để áp dụng các kỹ thuật vào trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền thì tách chiết DNA là khâu đầu tiên quan trọng nhất. Nếu các phân tử DNA được tách chiết tốt, không bị đứt gãy, không bị nhiễm thì các phản ứng tiếp theo mới có độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo quy trình phenol/chloroform. Theo Adelli K, quy trình phenol/chloroform mất nhiều thời gian và công sức nhưng phân tử DNA thu được có số lượng và chất lượng rất tốt [3]. Điều này được khẳng định khi chúng tôi kiểm tra kết quả tách chiết DNA bằng máy quang phổ thì nồng độ DNA thu được khá cao: 206 ng/µl, cao nhất là 2312,8 ng/µl. Độ tinh sạch thể hiện qua giá trị A260/A280 nằm trong giá trị 1,82-2,04. Chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng DNA với mồi GADPH, kết quả thu được: Tất cả các mẫu tách chiết DNA đều cho đoạn PCR với mồi GADPH đúng kích thước, rõ nét, không có vạch phụ. Sau khi thu được DNA có chất lượng tốt, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu exon 8 của gen TP53. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành dò nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ DNA… nhằm mục đích tối ưu hóa từng phản ứng PCR.Sản phẩm PCR thu được có thể tích là 10µl, chúng tôi tiến hành điện di 5 µl trên gel agarose 1,5%. Đánh giá kết quả các đoạn gen được phản ứng PCR khuyếch đại thông qua các vạch điện di. Các vạch điện di đều rõ nét, đúng kích thước và không có sản phẩm không đặc hiệu. Điều này chứng minh rằng các cặp mồi chúng tôi lựa chọn là đặc hiệu và các phản ứng PCR của chúng tôi đã được tối ưu hóa. Để xác định được đột biến gen TP53 ở exon 8, chúng tôi áp dụng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp. Ưu điểm của phương pháp này là có thể phát hiện được các đột biến điểm một cách chính xác – loại đột biến này cũng chiếm tỷ lệ cao trong các đột biến gen TP53.

1. 2. Xác định đột biến exon 8 gen TP53.
      1. Trong nghiên cứu của chúng tôi có 3 bệnh nhân đột biến exon 8, tỷ lệ 3/20 bệnh nhân. Theo nghiên cứu của Shiraishi S và các cộng sự (2002) số bệnh nhân đột biến là 55 trong tổng số 131 bệnh nhân [8]. Theo thống kê của IARC (2013) tỷ lệ đột biến exon 8 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm chiếm khoảng 28%. Có sự khác biệt này giữa nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu khác trên thế giới có thể do cỡ mẫu của chúng tôi chưa đủ lớn
      2. Các loại đột biến gen:
         1. Theo thống kê của L. Hjortsberg và cs (2008) bảng 5.2 đột chiếm tỷ lệ cao nhất là đột biến sai nghĩa 89%, đột biến vô nghĩa với tỉ lệ rất thấp 3%. Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 3 đột biến gồm: 1 đột biến vô nghĩa, 2 đột biến sai nghĩa, phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới [6].
         2. Vị trí codon bị đột biến:

Theo thống kê của IARC đến tháng 11 năm 2013 trong 850 đột biến được phát hiện, chưa phát hiện đột biến ở codon 264, ở codon 278 khoảng (1,8%), ở codon 283 khoảng (0,25%). Các codon có tần suất đột biến cao là codon 245 (3,75%), codon 282 (4,25%) , codon 175 (7%), codon 248 (8,75%), codon 273 (12,5%) [5]. Trong nghiên cứu của chúng tôi xác định được 3 đột biến lần lượt tại các codon 264, codon 278, codon 283.

V. KẾT LUẬN

1. 1. Áp dụng  thành công quy trình xác định đột biến exon 8 trên gen TP53 :

thu thập mẫu             tách chiết DNA         PCR khuyếch đại exon 8 của gen TP53

        giải trình tự gen             phân tích.

1. 2. Xác định được 3 đột biến sai nghĩa, tại các vị trí codon 264, codon 278, codon 283. Trong đó đột biến tại codon 264 chưa được mô tả trên IARC (2013).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phạm Hùng Vân (2009), "PCR và realtime-PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp", Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Tạ Thành Văn (2010), "PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

Tiếng Anh

3. Adeli K, Ogbonna M. (1990). Rapid purification of human DNA from whole blood for potential application in clinical chemistry laboratories. Clin Chem, 36 (2), pp. 261-264.
4. Eung Bae Lee, Guang Jin, Shin Yup Lee, et all. (2010). TP53 Mutations in Korean Patients with Non-small Cell Lung Cancer. J Korean Med Sci. 25: 698-705
5. International Agency for Research on Cancer (IARC) (2013). “p53 database”.
6. L. Hjortsberg và cs (2008), “p53 handbook 2.0” 70-74.
7. Takahashi R, Giannini C, Sarkaria JN, et al. (2013). p53 Isoform profiling in glioblastoma and injured brain.Oncogene. 32(26):3165–3174.
8. Shiraishi S, Tada K, Nakamura H, et al. (2002). “Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma” Cancer. 95(2),249-257.