2015 - 2016
- Nghiên cứu tính ổn định của đoạn gen thiết kế cặp mồi đặc hiệu

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA ĐOẠN GEN THIẾT KẾ CẶP MỒI ĐẶC HIỆU TRONG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH LIÊN CẦU NHÓM B Ở PHỤ NỮ MANG THAI

Nguyễn Hồng Phúc, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Bùi Thu Hằng, Nguyễn Minh Huệ, Nguyễn Trọng Tấn

Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội

Tóm tắt

          Gen cfb mã hóa cho yếu tố CAMP được sử dụng làm gen đích cho phản ứng PCR chẩn đoán liên cầu B ở phụ nữ mang thai tuần từ 34 - 37. So sánh trình tự đoạn gen này trên chủng S. agalactiaae ATCC 13813 với các chủng thu thập từ mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo, kết quả cho thấy sự tương đồng về trình tự như sau: 73,3% số chủng giống 100% so với chủng S. agalactiaae ATCC 13813; 26,7% số chủng có sự tương đồng từ 95,7% đến 99,3%.

Đặt vấn đề

Liên cầu nhóm B (Streptococcus agalactiae) là một trong những tác nhân gây bệnh gây bệnh và tử vong cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới. Vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng cho mẹ (ít gặp) như nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng ối, nhiễm trùng vết thương sau đẻ, hoặc gây nhiễm trùng cho con như nhiễm trùng huyết và viêm màng não mủ [3]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng chẩn đoán liên cầu B bằng phương pháp PCR có ưu điểm vượt trội về mặt thời gian và độ nhạy so với phương pháp nuôi cấy truyền thống [2, 4, 5, 6]. Phương pháp PCR chẩn đoán liên cầu B đã được áp dụng tại nhiều nơi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam phương pháp này mới bắt đầu được quan tâm đến [1]. Do đó, bước đầu xây dựng một quy trình chẩn đoán sinh học phân tử nhanh chóng và chính xác để sàng lọc trước sinh và chẩn đoán nhiễm trùng do liên cầu nhóm B là vấn đề nghiên cứu quan trọng, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, đóng góp tích cực cho công tác phòng và điều trị bệnh.

Xác định được đoạn gen đích phù hợp có vai trò quan trọng trong việc hoàn thiện quy trình PCR chẩn đoán liên cầu B. Chính vì vậy, nghiên cứu này đã lựa chọn gen cfb mã hóa cho yếu tố CAMP làm đích cho phản ứng PCR và xác định tính ổn định của đoạn gen này trên các chủng liên cầu B thu thập từ bệnh phẩm tại Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

          ADN chủng chuẩn S. agalactiaae ATCC 13813 và ADN 30 chủng liên cầu B thu thập từ dịch âm đạo của phụ nữ mang thai tuần từ 34 – 37.

Khuếch đại đoạn gen cfb của liên cầu B có kích thước 153 bp sử dụng cặp mồi Sag 59 (5’ – TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA – 3’) và Sag 190 (5’ – GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT – 3’) [1, 2]. Thành phần phản ứng: 1x PCR buffer minus Mg2+; 0,2 mM dNTPs; 3 mM MgCl2; 0,4 µM cặp mồi Sag 59 và Sag 190; 3 µl ADN khuôn; 1,0 unit Tag ADN Polymerase. Chu kỳ nhiệt: 950C/5’ (950C/30”, 550C/30”, 720C/30”) x 30 chu kỳ, 40C/ . Chứng dương là ADN chủng S. agalactiaae ATCC 13813, chứng âm là H2O.

Giải trình tự các chủng liên cầu B theo phương pháp Sanger, so sánh phân tích trình tự bằng phần mềm BioEdit và Mega 4.0.

Kết quả và bàn luận

          Kết quả PCR khếch đại đoạn gen cfb cho thấy tất cả các chủng trong nghiên cứu đều cho một vạch duy nhất khoảng 153 bp phù hợp với kích thước của đoạn gen đích dự kiến, kết quả này tương tự với các nghiên cứu sử dụng cùng cặp mồi [1, 2, 4, 6].

Hình 1. Kết quả khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu của Streptococcus agalactiae

M: Thang ADN chuẩn 100bp; 1: Chứng âm; 2: Chủng chuẩn ATCC 13813;

3 – 13: Chủng Streptococcus agalactiae dương tính với nuôi cấy

          Kết quả phân tích và so sánh trình tự đoạn gen cfb 153 bp của chủng chuẩn Streptococcus agalactiae ATCC 13813 trong nghiên cứu với trình tự đã được công bố trên GenBank (GL636070.1) và trình tự của đoạn gen cfb X72754 bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) cho thấy sự tương đồng 100% giữa các trình tự này. Kết quả này cho phép khẳng định mức độ chính xác của phản ứng PCR và sự tin cậy của kết quả giải trình tự. Trình tự của chủng Streptococcus agalactiae ATCC 13813 thu được từ thực nhiệm được sử dụng làm trình tự chuẩn để so sánh với trình tự các chủng thu thập được từ bệnh phẩm.

          So sánh trình tự của các chủng liên cầu B thu thập từ mẫu bệnh phẩm với trình tự của chủng chuẩn Streptococcus agalactiae ATCC 13813 cho thấy 73,3% tổng số chủng có sự tương đồng 100% so với chủng chuẩn, các chủng còn lại có sự tương đồng cao so với chủng (chuẩn từ 95,7 đến 99,3%).

Độ tương đồng so với chủng ATCC 13813 (%)

Số chủng nghiên cứu

Tỷ lệ %

100

22

73.3

99.3

2

6.7

98.6

1

3.3

96.4

1

3.3

95.7

4

13.4

Tổng

30

100

Bảng 1. Mức độ tương đồng của đoạn gen cfb giữa các chủng Streptococcus agalactiae trong nghiên cứu so với chủng ATCC 13813

So sánh trình tự giữa các chủng liên cầu B có sự khác biệt so với chủng chuẩn bằng phần mềm MEGA 4.0, kết quả thu được cho thấy sự tương đồng cao trình tự giữa các chủng này: chủng 9 có sự tương đồng 100% so với chủng 16; chủng 27 có sự tương đồng 100% với 31 (Bảng 2).

Ký hiệu chủng

S 13813

1

6

9

16

17

27

31

33

 

0

 

 

 

 

 

 

 

 

1

2

(1.4%)

0

 

 

 

 

 

 

 

6

1

(0.7%)

1

(0.7%)

0

 

 

 

 

 

 

9

6

(4.3%)

6

(4.3%)

5

(3.6%)

0

 

 

 

 

 

16

6

(4.3%)

6

(4.3%)

5

(3.6%)

0

0

 

 

 

 

17

1

(0.7%)

3

(2.1%)

2

(1.4%)

5

(3.6%)

5

(3.6%)

0

 

 

 

27

6

(4.3%)

8

(5.8%)

7

(5.1%)

2

(1.4%)

2

(1.4%)

5

(3.6%)

0

 

 

31

6

(4.3%)

8

(5.8%)

7

(5.1%)

2

(1.4%)

2

(1.4%)

5

(3.6%)

0

0

 

33

5

(3.6%)

7

(5.1%)

6

(4.3%)

2

(1.4%)

2

(1.4%)

4

(2.8%)

2

(1.4%)

2

(1.4%)

0

Bảng 2. Số nucleotide và tỷ lệ % sai khác giữa các chủng

Streptococcus agalactiae trong nghiên cứu

Các chủng 16, 27, 31, 33 có sự khác biệt đến 6 nucleotide so với chủng chuẩn nhưng các chủng này lại có sự tương đồng cao trong trình tự, chỉ khác nhau 2 nucleotide (1,4%). Từ sự khác biệt của các chủng này so với trình tự chủng chuẩn và sự tương đồng cao giữa các chủng này, nhóm nghiên cứu nhận thấy cần phải có những nghiên cứu tiếp theo với số lượng lớn hơn để có thể xác định được đây là sự biến đổi của các chủng GBS tại Việt Nam hay chỉ là sự đột biến xuất hiện trên một số ít chủng.

Kết luận và kiến nghị

          Trình tự đoạn gen cfb kích thước 153 bp có tính ổn định cao trên các chủng GBS trong nghiên cứu, 73,3% số chủng giống 100% so với chủng S. agalactiaae ATCC 13813; các chủng còn lại có sự tương đồng từ 95,7% đến 99,3% so với chủng chuẩn.

Từ kết quả thu được, nhóm nghiên cứu kiến nghị tiến hành thêm các nghiên cứu khác với số lượng mẫu lớn hơn để phân tích và so sánh trình tự gen cfb của các chủng GBS từ đó sẽ thu kết quả chính xác hơn, góp phần đưa kỹ thuât PCR chẩn đoán nhanh liên cầu B vào ứng dụng trong thực tế.

STUDY THE STABILITY OF THE FRAGMENT GENE DESIGN SPECIFIC PRIMER FOR RAPID PCR ASSAY TO IDENTIFY GROUP B STREPTOCOCCI IN PREGRANT WOMEN

 Summary

          The cfb gene encoding the CAMP factor was selected as the genetic target for the PCR assay to identify group B Streptococci in pregnant women from 34th to 37th weeks. The comparision of nucleotide sequence between S.agalactiae ATCC 13813 and strains. The strains were isolated from vaginal specimens showed the similarities of sequences as follows: 73,3% of the studied strains were identical with S.agalactiae ATCC 13813; 26.3 % were similar from 95,7% to 99,3% with the standard strain.

Gen cfb mã hóa cho yếu tố CAMP được sử dụng làm gen đích cho phản ứng PCR chẩn đoán liên cầu B ở phụ nữ mang thai tuần từ 34 - 37. Khi so sánh trình tự đoạn gen này trên chủng S. agalactiaae ATCC 13813 với các chủng thu thập từ mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo, kết quả cho thấy sự tương đồng về trình tự như sau: 73,3% số chủng giống 100% so với chủng S. agalactiaae ATCC 13813; 26,7% số chủng có sự tương đồng từ 95,7% đến 99,3%.

 

Tài liệu tham khảo

  1. Vũ Thị Kim Liên, Trần Thị Hải Âu và cs (2013). “Nghiên cứu xây dựng quy trình PCR chẩn đoán nhanh Streptococcus agalactiae ở phụ nữ mang thai”. Tạp chí Y học thực hành (893), số 11/2013, tr 22 – 25.
  2. Danbing Ke, Christian Menard… (2000). “Development of coventional and real – time PCR assays for Rapid detection of Group B streptococci”. Clinical chemistry; March 2000; Vol 46; No 3; pp 324 – 331.
  3. Centers for Disease Control Prevention (2010). “Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC”. Morbidity and Mortality Weekly Report, November 2010, Vol 59, No RR – 10.
  4. Fabien Rallu, Peter Barriga, Carole Scrivo... (2006). “Sensitivities of antigen detection and PCR assays greatly increased compared to that of the standard culture method for screening group B Streptococcus carriage in pregnant women”. Journal of clinical microbiology; March 2006; Vol 44; No 3; pp725 – 728.
  5. Fernanda de – Paris, Alice Beatriz Monbach Pinheiro Machado… (2010). “Group B streptococcus detection: comparison of PCR assay and culture as a screening method for pregnant woman”. Bzazilian Journal of Infaection Diseases; 2011; Vol. 15; No. 4; pp 323 - 327.
  6. Shahrokh Bidgani, Tahereh Navidifar, Mahin Najafian, Mansour Amin (2015). “Comparison of group B streptococci colonization in vaginal and rectal specimens by culture method and polymerase chain reaction technique”. Journal of the Chinese Medical Association 79 (2016), pp 141 – 145.
Hotline: 0866546673
Chat Facebook
Gọi điện